李秀明，馬儷珍*

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

硝酸鹽和亞硝酸鹽與人類生活密切相關(guān)，常應(yīng)用于腌肉制品中，具有防腐、發(fā)色等作用，而蔬菜作為人體日常維生素和纖維素的主要來源，含有較多的硝酸鹽，且硝酸鹽會在一定條件下還原為亞硝酸鹽[1]。大量的亞硝酸鹽進(jìn)入人體后，將攜氧的肌紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F肌紅蛋白，使人體組織缺氧，出現(xiàn)腸源性青紫癥，引發(fā)急性中毒，同時(shí)也會和人體內(nèi)的胺類結(jié)合生成亞硝胺等致癌物[2]，在給食品帶來良好色澤和貨架期的同時(shí)也給人體健康帶來了危害。根據(jù)國家限量標(biāo)準(zhǔn)，在肉制品中，硝酸鹽最大添加量為0.5 g/kg，亞硝酸鈉（鉀）最大殘留量均為30 mg/kg；亞硝酸鹽最大添加量為0.15 g/kg，除西式火腿類亞硝酸鈉最大殘留量不超過70 mg/kg，肉罐頭類不超過50 mg/kg，其他肉制品均不應(yīng)超過30 mg/kg[3]。

硝酸鹽常用的檢測方法有鎘柱還原法、紫外分光光度法[4]、離子色譜法[5-6]等，亞硝酸鹽常使用鹽酸萘乙二胺法[7]。但操作過程耗時(shí)較長，操作相對繁瑣，對于需要快速檢測的樣品不適用。特別是測定硝酸鹽時(shí)常用的鎘柱還原法，實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，不易控制鎘柱的還原率，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。快速檢測技術(shù)雖已經(jīng)在逐漸發(fā)展[8]，但其靈敏度和精確度仍得不到保證，因此尋找一個(gè)簡便、快捷、高效的檢測方法具有十分重要的意義。

高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近幾年發(fā)展最快的分析方法之一，其利用高壓電場，以電滲流（electro-osmotic flow，EOF）為驅(qū)動力，毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)各組分淌度及分配上的差異對樣品進(jìn)行分離[9]。進(jìn)樣端無死體積，分離過程中也無傳質(zhì)阻力的影響，其EOF為平流，在分離中不發(fā)生峰展寬的現(xiàn)象，分離效率高；分離模式和檢測方式靈活多變；具有分析速度快、高選擇性、樣品及試劑消耗量少等優(yōu)點(diǎn)[10]；若使用緩沖容量較大的分離緩沖液，只需少量即可多次使用；環(huán)境友好方面，HPCE通常只需簡單的緩沖鹽即可實(shí)現(xiàn)分離，如硼酸鹽、磷酸鹽。目前HPCE多數(shù)用于蛋白質(zhì)、氨基酸等的檢測[11-12]，在硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測方面的研究應(yīng)用相對較少。有部分學(xué)者將HPCE用于一些含鹽量低的樣品，如任紅星等[13]利用自組裝毛細(xì)管電泳裝置實(shí)現(xiàn)3 min內(nèi)測定水中的和，李珊等[14]利用HPCE在6 min內(nèi)使蔬菜樣品中和分離；Merusi等[15]考慮到硝酸鹽與亞硝酸鹽進(jìn)入人體食物的來源，利用極低pH 2.5的緩沖液在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對糖類及纖維素中硝酸鹽、亞硝酸鹽和草酸根的測定；Attila等[16]則將HPCE用于對唾液的測定中，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)，且體現(xiàn)出HPCE分離效率高的優(yōu)點(diǎn)。對于基質(zhì)較為復(fù)雜的肉類樣品，ztekin等[17]利用涂有聚乙烯亞胺的毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)肉制品中和分離，重復(fù)性好且分離速度快，但同時(shí)也增加了實(shí)驗(yàn)成本；Jastrz?bska[18]用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法實(shí)現(xiàn)了肉中和的測定。但對于高鹽含量的樣品，如咸菜、腌肉類制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的毛細(xì)管電泳檢測方法研究則鮮有報(bào)道，且由于Cl-容易對的測定產(chǎn)生干擾[19]，亦是測定高鹽含量樣品中和存在的難點(diǎn)。本研究目的在于利用HPCE的優(yōu)點(diǎn)解決常規(guī)測定果蔬和肉制品中硝酸鹽與亞硝酸鹽過程繁瑣、耗時(shí)長的問題，特別是肉制品中硝酸鹽的測定，以達(dá)到便捷、快速的目的；同時(shí)也對排除Cl-干擾方式進(jìn)行了研究，使HPCE不局限于低鹽含量的樣品，亦能測定常見的高鹽，且由于硝酸鹽與亞硝酸鹽含量較高容易引發(fā)食品中毒的樣品如咸菜、腌肉等，具有較強(qiáng)的實(shí)際意義，使得快速準(zhǔn)確的檢測成為可能，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了實(shí)驗(yàn)效率，為食品的安全監(jiān)測提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P/ACE MDQ HPCE（配備紫外檢測器） 美國貝克曼庫爾勒公司；熔融石英毛細(xì)管柱（總長度40 cm，有效長度30 cm，內(nèi)徑50 μm） 河北永年光導(dǎo)纖維廠；PB-10酸度計(jì) 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LLJ-A10T1攪拌機(jī) 廣東小熊電器有限公司；HS07-314恒溫水浴鍋 天津華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

硝酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鉀 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；硼酸、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無水硫酸鈉 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromid，CTAB） 北京索萊寶科技有限公司；分析過程所有用到的水均為Mili-Q超純水。

1.3 方法

1.3.1 電泳條件

毛細(xì)管柱活化程序：1 mol/L NaOH溶液沖洗20 min；1 mol/L HCl溶液沖洗20 min；超純水沖洗10 min。

每次進(jìn)樣前沖洗程序：1 mol/L NaOH溶液沖洗3 min；超純水沖洗2 min；分離緩沖液沖洗2 min。

條件：紫外波長214 nm，正極端進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力0.5 psi（即3 447.4 Pa），進(jìn)樣時(shí)間5 s，分離溫度25 ℃，分離電壓-5 kV，工作電流約62 μA。

分離緩沖液：400 mmol/L硼酸（2 mol/L KOH溶液調(diào)pH 9）+100 mmol/L Na2SO4+0.5 mmol/L CTAB。

準(zhǔn)確稱取0.247 g的硼酸于50 mL離心管中，加入少量超純水溶解，用2 mol/L KOH溶液調(diào)pH 9，分別加入2.5 mL 400 mmol/L Na2SO4、0.5 mL 10 mmol/L CTAB溶液，用超純水定容至10 mL。

1.3.2 樣品制備及前處理

水果、蔬菜及肉制品（C l-含量均應(yīng)小于500 mmol/L）通過攪拌機(jī)粉碎勻漿以備用。

果蔬及肉制品樣品：取1 g樣品，加入超純水約5 mL，于50 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min后，取出冷卻至室溫，用超純水定容至10 mL，用濾紙過濾，濾液用0.22 μm孔徑濾膜過濾即可上機(jī)（可適當(dāng)調(diào)整試樣的稀釋倍數(shù)）。

1.3.3 加標(biāo)回收率

采用樣品加標(biāo)回收的方法，分別稱取4 份質(zhì)量為1.000 g的樣品，一份不加入混標(biāo)，另外3 份分別加2、4、6 μg/mL硝酸鈉和亞硝酸鈉混標(biāo)，按照樣品前處理方法進(jìn)行，然后用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法檢測，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將硝酸鈉與亞硝酸鈉干燥至質(zhì)量恒定，分別準(zhǔn)確稱取1.000 g和0.100 g，加水溶解并定容至500 mL，配制為2 000 μg/mL和200 μg/mL質(zhì)量濃度的硝酸鈉與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液。對于肉類樣品，可將兩種儲備液均梯度稀釋為0.2、0.5、1、5、10、20、40 μg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液；對于果蔬類含硝酸鹽較高的樣品，可將硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液梯度稀釋為2、5、10、50、100、200、400 μg/mL，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液梯度稀釋為0.2、0.5、1、5、10、20、40 μg/mL，將兩者混合制得標(biāo)準(zhǔn)使用液。按照最適分離條件分析，制作以峰面積為橫坐標(biāo)，硝酸鈉和亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 檢出限的確定

最低檢出限指某種分析方法能從待測樣品中檢測到的最低質(zhì)量濃度。參照劉威[20]的方法進(jìn)行測定，將一個(gè)已知濃度接近于空白的標(biāo)準(zhǔn)品多次測定，得到測量讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值，以信噪比為3時(shí)，確定儀器檢出限。用相應(yīng)于儀器檢出限3～5 倍的質(zhì)量濃度配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)樣品所有分析過程進(jìn)行操作，且多次測定計(jì)算方法的檢出限。計(jì)算公式如下：

式中：k為置信因子，取3；Sb為空白標(biāo)品多次測定讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C為測量質(zhì)量濃度/（μg/mL）；X為空白多次測量讀數(shù)平均值，即峰面積。

1.3.6 精密度檢測

取10 μg/mL的硝酸鈉和亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，分別在日內(nèi)和日間進(jìn)行平行測定3 次，計(jì)算兩個(gè)被測物日內(nèi)和日間3 次測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），RSD越低，說明方法的精密度越高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越準(zhǔn)確。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用32 Karat Software、SigmaPlot 10.0作圖，Statistix 8.1對結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離緩沖液pH值的選擇

由于亞硝酸鹽不穩(wěn)定，在酸性條件下易被分解，因此在選擇分離緩沖液時(shí)需考慮到其pH值，應(yīng)選用緩沖范圍為堿性的緩沖鹽。根據(jù)弱酸和弱堿的pKa，估算得到常用緩沖鹽如磷酸鹽的緩沖范圍為pH 1.12～3.12、pH 6.2～8.2、pH 11.36～13.36，硼酸鹽的緩沖范圍為pH 8.24～10.24[21]，結(jié)合Frazier等[22]研究的未涂層熔融石英毛細(xì)管內(nèi)EOF和pH值的關(guān)系曲線可知，若要獲得良好的定量及重復(fù)性，應(yīng)盡量使用pH值小于3和pH值在8～10的分離緩沖液，當(dāng)pH值大于10時(shí)，將會很容易吸收空氣中的CO2，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了硼酸為分離緩沖液。但硼酸初始值為酸性，選擇一種堿調(diào)節(jié)劑是至關(guān)重要的。根據(jù)王茜等[23]對不同堿調(diào)節(jié)緩沖鹽pH值時(shí)電導(dǎo)率的測定，得到電導(dǎo)率從大到小順序?yàn)镃sOH＞KOH＞NaOH＞LiOH，其中CsOH電導(dǎo)率最大。在選擇分離緩沖液時(shí)，需要注意分離緩沖液的電導(dǎo)應(yīng)大于樣品緩沖液的電導(dǎo)，且電導(dǎo)差異越大，樣品分離度越高，因此電導(dǎo)率最大的CsOH應(yīng)是不錯(cuò)的選擇，但出于實(shí)驗(yàn)條件及成本的考慮，本實(shí)驗(yàn)選用了電導(dǎo)率較大的KOH作為堿調(diào)節(jié)劑。

由于本實(shí)驗(yàn)選用硼酸作為分離緩沖液，其pH值緩沖范圍為8.24～10.24，因此本實(shí)驗(yàn)對pH值為8.5、9、9.5、10的背景電解質(zhì)進(jìn)行篩選，同時(shí)保證其他實(shí)驗(yàn)條件相同。圖1表明，隨著pH值的升高，EOF會逐漸增加[21]，電子遷移速度加快，被測物出峰時(shí)間縮短，分離電流不斷變大，響應(yīng)值卻逐漸變小，但均能實(shí)現(xiàn)較好的分離，其中的峰先到達(dá)檢測窗口。這是由于本實(shí)驗(yàn)采用了電極反向的方式，同時(shí)添加了EOF改性劑，被分析物為帶相同電荷的陰離子，相對分子質(zhì)量大的陰離子向正極移動的速度較慢，而EOF的方向同陰離子移動的方向一致，因此相對分子質(zhì)量小的則先被推送至窗口。由于分離過快導(dǎo)致響應(yīng)值變低，同時(shí)為了避免電流過高，并未對pH 10進(jìn)行篩選，最終選擇最佳pH 9，分離時(shí)間相對較快，且響應(yīng)值高。

圖1 不同pH值分離緩沖液對硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)分離的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite

2.2 分離緩沖液濃度對分離的影響

分離緩沖溶液的濃度對待測物的分離度、檢測靈敏度、工作電流都有著重要影響。當(dāng)分離緩沖液濃度較低時(shí)，會與樣品緩沖溶液不匹配，兩者電導(dǎo)差異不大，無法實(shí)現(xiàn)有效分離，且緩沖容量不足，導(dǎo)致測定結(jié)果不穩(wěn)定，需勤換分離緩沖液[24]；若濃度過高，會產(chǎn)生大量的焦耳熱，EOF降低，使被測物的分離度、響應(yīng)值、檢測靈敏度下降，因此在探索方法時(shí)有必要對分離緩沖液的濃度進(jìn)行篩選，以得到最佳分離條件。本實(shí)驗(yàn)預(yù)將對500、400、300、200、100 mmol/L濃度的硼酸進(jìn)行篩選，其余條件均保持一致。如圖2所示，當(dāng)硼酸緩沖液濃度為300～500 mmol/L范圍時(shí)，硼酸濃度越低，出峰時(shí)間越早，響應(yīng)值越低，分離度變小。觀察緩沖液濃度為300 mmol/L時(shí)的峰形變化，的峰形已經(jīng)變差，峰展寬且響應(yīng)值急劇降低，因此未繼續(xù)對100 mmol/L和200 mmol/L濃度的硼酸進(jìn)行比較。從圖2可以看出，400 mmol/L和500 mmol/L均能實(shí)現(xiàn)較好的分離，但是為防止產(chǎn)生過多的焦耳熱，應(yīng)選擇能夠有效分離并且濃度相對較低的緩沖鹽濃度，因此本實(shí)驗(yàn)選用400 mmol/L為分離緩沖液中硼酸的最適濃度。

圖2 硼酸濃度對硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)分離的影響Fig.2 Effect of boric acid concentration on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite

2.3 EOF反向劑濃度的選擇

和均為無機(jī)陰離子，帶負(fù)電，在電離時(shí)，陰離子總是向正極移動，在電極正向時(shí)EOF由正極走向負(fù)極，而檢測窗口靠近負(fù)極，故會導(dǎo)致陰離子到達(dá)檢測窗口的時(shí)間延長，并且和的淌度較大，更容易出現(xiàn)不能在合理時(shí)間內(nèi)出峰的現(xiàn)象[25]。故為快速有效地分離，應(yīng)選用EOF改性劑CTAB[26]，在改變EOF方向的同時(shí)，又采用反向電壓，使得待測離子與EOF移動方向一致，縮短了分離時(shí)間。根據(jù)Reinhard等[27]的研究結(jié)果，當(dāng)CTAB濃度為0.35 mmol/L時(shí)，可達(dá)到EOF反向的作用，因此本實(shí)驗(yàn)分別對0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L添加量的CTAB進(jìn)行篩選。如圖3A所示，隨著CTAB濃度的增大，兩個(gè)陰離子峰的分離度逐漸變大；對比0.4 mmol/L濃度的電泳圖，另外3 個(gè)濃度的出峰時(shí)間稍微提前，三者出峰時(shí)間差異不大；而響應(yīng)值變化如圖3B所示，在CTAB為0.5 mmol/L濃度時(shí)達(dá)到最大，且隨濃度的繼續(xù)增大，響應(yīng)值呈降低趨勢。綜合來看，0.5 mmol/L的CTAB為最適添加量。

圖3 CTAB濃度對硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)的分離（A）和與峰面積（B）的影響Fig.3 Effect of CTAB concentration on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite (A), and peak areas of and (B)

2.4 排除Cl-干擾方法分析

將上述優(yōu)化出的最適分離緩沖液（400 mmol/L硼酸+2 mol/L KOH溶液調(diào)pH 9+0.5 mmol/L CTAB）應(yīng)用于實(shí)際樣品（如洋白菜和紅腸）的測定，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)兩者的峰形較好，但在紅腸樣品圖4B中出峰位置有雜峰干擾現(xiàn)象，無法得到亞硝酸鹽的含量。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，如在陸瑩等[19]研究得到當(dāng)質(zhì)量濃度小于0.5 mg/L時(shí)，干擾會隨著Cl-、質(zhì)量濃度比的增大而增加；肖雙等[28]提到Cl-和與固定相的親和力相近，保留時(shí)間相似，而當(dāng)Cl-含量較高時(shí)，會干擾的測定，同時(shí)還介紹了可以采用過Ag柱和Na柱的方式去除Cl-；姜廷福等[29]在測定腌菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽時(shí)通過在分離緩沖液中添加2 倍樣品NaCl的方式降低高濃度鹽對的干擾。根據(jù)以上資料結(jié)果，并且經(jīng)過加標(biāo)驗(yàn)證，得到該雜峰的確是由Cl-造成的。究其原因，是由于樣品中的高濃度鹽破壞了電堆積效應(yīng)，使樣品溶液的電導(dǎo)與分離緩沖液的電導(dǎo)差異變小，兩者電導(dǎo)值不匹配，而一些樣品中含鹽量較高，不能通過簡單改變分離緩沖液濃度或者電壓使其較好地分離。經(jīng)查閱資料，可從以下兩個(gè)方面探索消除Cl-干擾：1）對樣品進(jìn)行前處理（如過固相萃取小柱Ag柱）去除Cl-[30]；2）在分離緩沖液中添加中性鹽[19]，從而保持其離子強(qiáng)度，增大電導(dǎo)差異。為降低成本，實(shí)驗(yàn)分別通過在樣品濾液中添加AgNO3和在分離緩沖液中添加Na2SO4測定含鹽樣品硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法。

圖4 分離洋白菜（A）和紅腸（B）中硝酸鹽與亞硝酸鹽的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.4 Capillary electrophoresis chromatograms of nitrate and nitrite in cabbage (A) and red sausage (B)

2.4.1 添加AgNO3的影響

圖5 向含有40 mmol/L NaCl的10 μg/mL硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)中添加50 mmol/L AgNO3的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.5 Capillary electrophoresis chromatograms of 50 mmol/L AgNO3 added to the mixture of 10 μg/mL sodium nitrate and sodium nitrite containing 40 mmol/L NaCl

通過添加AgNO3的方式排除Cl-干擾。根據(jù)Ag+可以和Cl-反應(yīng)生成AgCl沉淀，猜想通過添加硝酸銀的方式去除Cl-，以此降低Cl-對的干擾，雖然同時(shí)加入了，但可通過檢測到的總量減去加入量來獲得實(shí)際含量。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)AgNO3添加量大于Cl-含量時(shí)，如圖5所示，能夠改善Cl-干擾，但Ag+的強(qiáng)氧化性，將部分氧化，響應(yīng)值變低，峰面積增大且峰展寬，兩者峰形均不好。若將此方法應(yīng)用于實(shí)踐中，需先測出樣品中Cl-含量，再根據(jù)所需等比例將AgNO3加入樣品中以去除Cl-，否則當(dāng)添加量低時(shí)，不能完全被Ag+沉淀的Cl-仍會干擾的測定；添加量多時(shí)，多出的Ag+可能會氧化，使結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，該方法并不適用也不實(shí)用。

2.4.2 添加Na2SO4的影響

配制10 μg/mL含有20 mmol/L NaCl的硝酸鹽與亞硝酸鹽混標(biāo)，向分離緩沖液中分別加入20、40、80 mmol/L的Na2SO4，但隨著其濃度的增加，為避免工作電流超過100 μA，分離電壓也應(yīng)當(dāng)相應(yīng)降低，因此將電壓均設(shè)為-7 kV。如圖6所示，隨Na2SO4添加量的增大，緩沖液濃度增加，分離時(shí)間逐漸增加，其中由Cl-產(chǎn)生的干擾峰逐漸與的峰分離，且分離度逐漸變大，同時(shí)不對出峰產(chǎn)生干擾，可見通過添加Na2SO4的方法可行。根據(jù)Na2SO4添加量和NaCl含量的比例可以看出，當(dāng)Na2SO4、NaCl濃度比為2時(shí)，已經(jīng)能夠排除Cl-的干擾，但當(dāng)Na2SO4添加量較高時(shí)，被測物出現(xiàn)峰展寬的現(xiàn)象，這是由于分離電壓與分離緩沖液濃度不匹配，分離電壓相對較高，此時(shí)分離電流已經(jīng)達(dá)到84.3 μA。因此在添加高濃度Na2SO4時(shí)，需要對分離電壓進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

圖6 Na2SO4添加量對含有20 mmol/L NaCl的硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)分離的影響Fig.6 Effect of Na2SO4 addition on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite containing 20 mmol/L NaCl

2.5 分離電壓的選擇

結(jié)合以上優(yōu)化結(jié)果、參考文獻(xiàn)中高鹽含量樣品[26]的含鹽量以及本實(shí)驗(yàn)中樣品前處理方式，以最大能夠檢測含500 mmol/L NaCl的樣品為例，即在分離緩沖液中添加100 mmol/L的Na2SO4，并對分離電壓進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)-7 kV時(shí)，添加20、40、80 mmol/L Na2SO4的電流分別為52.4、63.1、84.3 μA，預(yù)估添加100 mmol/L的Na2SO4電流不會超過100 μA，因此分別對-7、-6、-5、-4 kV電壓進(jìn)行篩選。結(jié)果如表1和圖7所示，隨著分離電壓降低，分離時(shí)間逐漸延長，響應(yīng)值逐漸變大，但當(dāng)分離電壓為-4 kV時(shí)，兩峰峰展寬，不利于分離較低濃度的樣品；-7 kV條件下雖出峰時(shí)間快，但響應(yīng)值偏低，且工作電流較大；對比-5、-6 kV分離效果，-5 kV工作電流較低，且響應(yīng)值較大，峰形好，故確定-5 kV為最適分離電壓。

表1 不同電壓下分離與時(shí)的工作電流、保留時(shí)間及峰面積Table1 Operating currents, retention times and peak areas of NO－2 and at different separation voltages

表1 不同電壓下分離與時(shí)的工作電流、保留時(shí)間及峰面積Table1 Operating currents, retention times and peak areas of NO－2 and at different separation voltages

分離電壓/kV工作電流/μA NO2- NO3-保留時(shí)間/min 峰面積 保留時(shí)間/min 峰面積-7 89.5 3.354 5 374 3.575 6 320-6 75.5 3.962 6 075 4.225 7 239-5 61.8 4.629 7 868 5.150 8 980-4 48.4 6.088 9 528 6.496 10 940

圖7 電壓對硝酸鈉與亞硝酸鈉混標(biāo)分離的影響Fig.7 Effect of different voltages on the separation of sodium nitrate and sodium nitrite

2.6 方法的回收率、線性、檢出限和精密度

經(jīng)過加標(biāo)檢測得到方法的加標(biāo)回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限如表2所示，優(yōu)化出的實(shí)驗(yàn)方法加標(biāo)回收率在81.82%～100.91%之間，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，檢出限則分別為0.69 μg/mL和0.50 μg/mL。經(jīng)日內(nèi)和日間3 次平行測定，得到方法日內(nèi)和日間的精密度如表3所示，相對峰面積的RSD在1.4%～3.2%之間，說明該方法的精密度良好。

表2 方法的加標(biāo)回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限Table2 Recoveries, standard curve equations and LODs of the method

表3 方法的精密度Table3 Precision of the method

2.7 樣品檢測結(jié)果

用最適實(shí)驗(yàn)條件，對一些常見的含有硝酸鹽和亞硝酸鹽的樣品進(jìn)行測定，對比國標(biāo)方法，采用鹽酸萘乙二胺法檢測肉制品中的亞硝酸鹽，但用來測定肉類中硝酸鹽的鎘柱還原法難以實(shí)現(xiàn)，還原率不穩(wěn)定，因此未對肉制品中硝酸鹽進(jìn)行測定；結(jié)合紫外分光光度法對蔬菜中硝酸鹽的測定結(jié)果，如表4所示，本方法與國標(biāo)法的測定結(jié)果基本一致，說明該方法具有可行性。其中芹菜和自制香腸的毛細(xì)管電泳圖譜分別如圖8所示。由測定結(jié)果看出，芹菜葉中硝酸鹽含量很高，達(dá)到（3 115.49±1.41）mg/kg；對于次新鮮狀態(tài)的圓生菜，部分硝酸鹽已經(jīng)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，直接威脅人們的健康，同時(shí)也說明生活中應(yīng)盡量食用新鮮蔬菜；自制香腸中的亞硝酸鹽達(dá)到了（74.13±1.20）mg/kg，已經(jīng)遠(yuǎn)超過了國家限量標(biāo)準(zhǔn)，存在著食品安全隱患?？梢姡瑢κ称分邢跛猁}和亞硝酸鹽含量的監(jiān)控是十分必要的，而本研究所建立的方法能夠快速準(zhǔn)確測定對食品安全有著重要的實(shí)際意義。

表4 5 種樣品的硝酸鹽與亞硝酸鹽含量測定結(jié)果Table4 Determination of nitrate and nitrite contents in fi ve samples

圖8 分離芹菜（A）和自制香腸（B）中硝酸鹽與亞硝酸鹽的毛細(xì)管電泳圖譜Fig.8 Capillary electrophoresis chromatograms of nitrate and nitrite in celery (A) and sausages (B)

3 結(jié) 論

本研究排除Cl-的干擾，建立了一種能夠同時(shí)快速檢測高鹽含量的果蔬及肉制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法，即使用內(nèi)徑50 μm，總長40 cm，有效長度30 cm的毛細(xì)管柱，在214 nm條件下，以400 mmol/L硼酸（2 mol/L KOH溶液調(diào)pH 9）+100 mmol/L Na2SO4+0.5 mmol/L CTAB為分離緩沖液，分離電壓-5 kV，操作溫度25 ℃，0.5 psi（即3 447.4 Pa）壓力下進(jìn)樣5 s時(shí)，可將含鹽量500 mmol/L以下的樣品在6 min內(nèi)硝酸鹽和亞硝酸鹽達(dá)到分離，該方法的加標(biāo)回收率在81.82%～100.91%之間，對于肉類和果蔬類樣品，硝酸鹽的線性范圍分別為0.2～40 μg/mL 和2～400 μg/mL，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度的線性范圍均為0.2～40 μg/mL，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，檢出限分別為0.69 μg/mL和0.50 μg/mL，精密度不高于3.2%。該方法回收率高、精密度良好、操作簡便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低，不僅增強(qiáng)了食品安全快速準(zhǔn)確監(jiān)控的可能性，同時(shí)利用了HPCE的優(yōu)點(diǎn)，使其不僅局限于對蛋白、肽、氨基酸等的測定，亦提高了它的實(shí)用價(jià)值。

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