，，，

1.大連市友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 大連 116000； 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科； 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ubiquitin specific peptidase 22 (USP22) on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells and its possible molecular mechanism.MethodsRT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of USP22 mRNA and protein in human normal Chang liver cells and human hepatoma HepG2 cells. The USP22 gene was silenced by transfection of USP22-siRNA with liposome, and the silencing effect was detected by RT-PCR and Western blotting. The effects of USP22 gene silencing on HepG2 cell cycle and apoptosis were investigated by flow cytometry, and Western blotting was used to detect the effect of USP22 gene silencing on the expressions of Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-9, Cyclin D1 and CDK2 proteins.ResultsThe expression of USP22 gene in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells was significantly higher than that in human normal Chang liver cells (P<0.05). After siRNA interference with HepG2 cells, the expressions of USP22 mRNA and protein in the intervention group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), but there was no significant difference in the negative group (P>0.05). After the siRNA interfered with HepG2 cells, compared with the control group, the expressions of USP22 mRNA and protein in the intervention group were significantly decreased (P<0.05), but the difference in the negative group was not significant (P>0.05). After silence of the USP22 gene, compared with the control group, the proportion of G0/G1phase cells was significantly increased, the proportions of S phase and G2/M phase cells were decreased significantly, and the rate of apoptosis was increased significantly, whose differences were statistically significant (P<0.05); but there was no significant difference in the percentage of G0/G1phase, phase S and phase G2/M cells and apoptosis rate between the negative group and the control group (P>0.05). Compared with the control group, the relative expressions of Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-9, Cyclin D1 and CDK2 proteins in the intervention group were significantly reduced (P<0.05), and the difference between the negative group and the control

group was not significant (P>0.05).ConclusionThe gene silencing of USP22 can induce apoptosis of HepG2 cells in hepatocellular carcinoma, and its mechanism may be related to the decline in expression of cell cycle correlated proteins Cyclin D1, CDK2, and apoptotic proteins Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9.

【Keywords】 Hepatocellular carcinoma; USP22; Apoptosis; Cell cycle

肝癌是一種常見的發(fā)生在肝臟的惡性腫瘤，是人類疾病死亡致死的第二大因素。2015年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1-2]顯示，2012年世界上新增肝癌患者約78萬(wàn)，中國(guó)約占其發(fā)病率和死亡率的50%。近年來(lái)，我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率有明顯上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人們的健康和生活。研究表明，肝癌的發(fā)生與飲水污染、酒精、肝炎病毒、性激素和肝硬化等多種因素密切相關(guān)，但肝癌具體的發(fā)病機(jī)制并不明確，在肝癌的預(yù)防和治療方面，我國(guó)面臨著很大的挑戰(zhàn)。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，研究肝癌細(xì)胞的分子機(jī)制對(duì)肝癌的治療和預(yù)防具有重要意義。隨著肝癌研究的不斷深入，尋找抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡的有效靶點(diǎn)一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。

泛素特異性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)是一種泛素特異性肽酶，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)等生化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是一個(gè)多階段、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過程，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的負(fù)調(diào)控作用，研究USP22在肝癌細(xì)胞凋亡中分子機(jī)制，為肝癌的靶向分子治療提供了新方向。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，USP22在甲狀腺癌、肺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，USP22在肝癌中高表達(dá)，但其對(duì)肝癌的作用機(jī)制并不明確。目前，關(guān)于USP22對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究較少，因此，本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法干擾肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中USP22表達(dá)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人正常肝Chang liver細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。USP22-siRNA和Control-siRNA、USP22引物和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物均由北京華大基因有限公司合成，其中USP22-siRNA片段正義鏈序列為5′-GAAGCAUAUUCACGAGCAUTT-3′，反義鏈序列為3′-TTCUUCGUAUAAGUGCUCGUA-5′。Control-siRNA片段正義鏈序列為5′-GAGAAGACUACUCAAGCATT-3′，反義鏈序列為3′-TTCUCUUCUGAUGAGUUCGUA-5′。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青有限公司，胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000、Trizol試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司。RT-PCR試劑盒、細(xì)胞蛋白提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自大連TaKaRa公司。兔抗人USP22、GAPDH、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved caspase-3)、Cleaved caspase-9、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(recombinant Cyclin dependent kinase 2，CDK2)抗體和HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(IgG-HRP)二抗均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：將人正常肝Chang liver細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞于37 ℃水浴解凍復(fù)蘇后，以1×106個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種至含有質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基上，置于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、濕度為95%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，加質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以1×104個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種至6孔細(xì)胞板上，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度為70%以上時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書的操作步驟轉(zhuǎn)染干預(yù)組和陰性組的細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染USP22-siRNA片段序列的細(xì)胞為干預(yù)組，以轉(zhuǎn)染Control-siRNA片段序列的細(xì)胞為陰性組，以不做任何處理的細(xì)胞為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后在常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)USP22 mRNA的表達(dá)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Chang liver細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，采用Trizol法提取兩組細(xì)胞的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟合成cDNA。以cDNA為模板RT-PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因?？偡磻?yīng)體系為20 μl，其中，cDNA模板為2 μl，USP22引物或GAPDH引物各1 μl，PCR master Mix 10 μl、ddH2O 6 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min(1個(gè)循環(huán))，95 ℃變性30 s(35個(gè)循環(huán))，60 ℃退火30 s(35個(gè)循環(huán))，72 ℃ 延伸30 s(35個(gè)循環(huán))，72 ℃總延伸4 min(1個(gè)循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算USP22 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。擴(kuò)增USP22引物上游序列為5′-GGCGGAAGATCACCACGTAT-3′，下游序列為5′-TTGTTGAGACTGTCCGTGGG-3′，GAPDH引物上游序列5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游序列為5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。根據(jù)上述方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的干預(yù)組、陰性組和對(duì)照組細(xì)胞中USP22 mRNA的表達(dá)水平。其中，所有實(shí)驗(yàn)過程中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后取均值。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)USP22蛋白的表達(dá)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Chang liver細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取兩組細(xì)胞的總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒的操作步驟檢測(cè)提取總蛋白的濃度和純度。將總蛋白與上樣緩沖液按等比例混勻后，沸煮5 min，以每孔50 μl蛋白樣品上樣，于質(zhì)量濃度為100 g/L的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，取出蛋白凝膠，在400 mA恒流條件下轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，放入含有質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液中封閉2 h，加入特異性一抗USP22抗體(600倍稀釋)和GAPDH抗體(1 000倍稀釋)，在4 ℃環(huán)境中孵育過夜，再與稀釋1 000倍的二抗(IgG-HRP)37 ℃反應(yīng)2 h，以ECL發(fā)光試劑盒處理，顯影曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析USP22蛋白的表達(dá)水平。采用同樣的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的干預(yù)組、陰性組和對(duì)照組細(xì)胞中USP22蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況：收集轉(zhuǎn)染48 h的干預(yù)組、陰性組和對(duì)照組細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，以2 000 r/min離心(離心半徑r=12.4 cm)10 min，棄酶消化液，加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml。根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布和細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyclin D1和CDK2蛋白的表達(dá)：取對(duì)照組、陰性組和干預(yù)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)1.2.3中的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)三組細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyclin D1和CDK2蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1USP22在肝癌HepG2細(xì)胞中高表達(dá)RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與人正常肝Chang liver細(xì)胞相比，HepG2細(xì)胞中USP22 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1、表1)。

圖1 Western blotting檢測(cè)Chang liver細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中USP22蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig 1 The expressions of USP22 protein in Chang liver cells and HepG2 cells detected by Western blotting

注：與Chang liver細(xì)胞相比，aP<0.05。

2.2USP22siRNA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中USP22基因表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干預(yù)組中USP22 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而陰性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、表2)。

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中USP22蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig 2 The expression of USP22 protein after 48 hours of transfection detected by Western blotting

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05。

2.3USP22基因沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞中的細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干預(yù)組中G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期和G2/M期細(xì)胞所占比例顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。陰性組和對(duì)照組間G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組、陰性組和干預(yù)組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.86±1.26)%、(7.35±1.65)%和(27.58±5.22)%。與對(duì)照組相比，陰性組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(見圖3～4)。

表3 USP22 siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 Tab 3 The effect of USP22 siRNA on the cell cycle of

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05。

圖3 USP22基因沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

A：對(duì)照組；B：陰性組；C：干預(yù)組

Fig3TheapoptosisofHepG2cellsineachgroupdetectedbyflowcytometry

A: control group; B: negative group;
C: intervention group

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

圖4各組HepG2細(xì)胞的凋亡率
Fig4TheapoptosisrateofHepG2cellsineachgroup

2.4USP22基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞中Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9、CyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染48 h后，Western blotting檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyclin D1和CDK2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干預(yù)組中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1和CDK2

蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性組中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyclin D1和CDK2蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖5、表4)。

圖5 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Cyclin D1和CDK2蛋白的表達(dá)Fig 5 The expressions of Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-9, Cyclin D1 and CDK2 proteins in each group after transfection for 48 hours detected by Western blotting

組別Cleaved caspase-3Cleaved caspase-9Cyclin D1CDK2對(duì)照組0.45±0.050.53±0.080.96±0.120.48±0.08陰性組0.42±0.060.50±0.100.87±0.250.46±0.12干預(yù)組0.15±0.08a0.26±0.15a0.32±0.18a0.21±0.10a

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05。

3 討論

USP22基因是去泛素化酶家族的重要成員，位于17p11.2染色體上，可編碼525個(gè)氨基酸。它通過形成復(fù)合體后在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生理過程中發(fā)揮作用。大量研究[5-7，9]發(fā)現(xiàn)，USP22在多種腫瘤器官或組織中呈高表達(dá)，抑制或沉默其表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)USP22可通過抑制TERT/P53途徑促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。JI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抑制USP22表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，其作用機(jī)制可能與致癌轉(zhuǎn)化因子TGFβ1誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯有關(guān)。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，USP22在肝癌組織中高表達(dá)，且與肝癌患者預(yù)后差密切相關(guān)。因此，研究USP22基因在肝癌細(xì)胞中的作用對(duì)肝癌的診斷和治療具有重要意義。細(xì)胞的無(wú)限增殖與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)，研究肝癌的細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)抗肝癌的研究具有重要影響。目前，關(guān)于USP22基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡的研究較少，其具體的作用機(jī)制尚不明確，本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法干擾肝癌HepG2細(xì)胞中USP22表達(dá)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高。進(jìn)一步觀察HepG2細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干預(yù)組中G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期和G2/M期細(xì)胞所占比例顯著下降。結(jié)果提示，沉默USP22基因可能通過將細(xì)胞周期阻滯G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程。越來(lái)越多的研究[13-15]認(rèn)為，細(xì)胞周期的失調(diào)是腫瘤形成的原因，細(xì)胞周期在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)在整個(gè)細(xì)胞周期的推進(jìn)進(jìn)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[12]。Cyclin D1是Cyclins家族的重要成員，被認(rèn)為是細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，在細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CDK2蛋白作為CDKs蛋白家族中的一員，在細(xì)胞周期各時(shí)相間的相互轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用。研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1和CDK2在乳腺癌、肝癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，在多種腫瘤的診斷和治療方面具有重要作用。USP22基因?qū)yclin D1和CDK2蛋白的表達(dá)有一定的影響。如LI等[19]通過RNA干擾介導(dǎo)USP22基因沉默后，發(fā)現(xiàn)有效抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，同時(shí)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，周期相關(guān)蛋白CDK1、CDK2和Cyclin B1表達(dá)顯著減少。ZHUANG等[20]在慢病毒介導(dǎo)USP22基因沉默抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)Akt信號(hào)通路影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌CNE-1和CNE-2細(xì)胞中沉默USP22基因后，可通過下調(diào)p-Akt、p-gsk-3β和Cyclin D1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和影響細(xì)胞G0/G1期。為了探討USP22基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞周期作用的分子機(jī)制，本研究通過Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后的HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組中Cyclin D1和CDK2蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著下降。結(jié)果提示，USP22基因沉默可能通過下調(diào)Cyclin D1和CDK2表達(dá)將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的細(xì)胞主動(dòng)死亡的有序過程，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Caspase家族是一種以非活化狀態(tài)存在于細(xì)胞漿內(nèi)的蛋白酶，在凋亡誘導(dǎo)、凋亡執(zhí)行和凋亡效應(yīng)途徑中發(fā)揮著重要作用。Caspase-3是Caspase家族中級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的重要凋亡執(zhí)行因子，Caspase-9是Caspase家族中級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游的凋亡啟動(dòng)因子，一旦Caspase酶原活化為有活性的Caspase，將引起細(xì)胞凋亡[21]。SHI等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的足細(xì)胞中沉默USP22基因，可通過降低Bax/Bcl-2比值、Caspase-3的表達(dá)和TNF-α等炎癥因子的分泌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。李朝暉等[23]在研究siRNA沉默USP22基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用中發(fā)現(xiàn)，沉默USP22基因后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率明顯升高，且凋亡相關(guān)蛋白Procaspase-3和Procaspase-9表達(dá)明顯下降。為了探討USP22基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究采用Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干預(yù)組中Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)均顯著降低。結(jié)果提示，沉默USP22基因可能通過下調(diào)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

總之，USP22基因在肝癌細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用，USP22基因沉默可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與周期蛋白Cyclin D1、CDK2及凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達(dá)下降有關(guān)。肝癌細(xì)胞的凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，USP22基因在肝癌中的具體作用機(jī)制還需更多更深入的研究。本研究結(jié)果為USP22基因在肝癌中的分子機(jī)制研究提供了參考，為肝癌的診斷和治療提供了新的研究方向和治療靶點(diǎn)。

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