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1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，廣西 南寧 530023； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院

【Abstract】ObjectiveTo improve the technique of cardiac steel ring implantation and fixation, and to establish the rat modeling method of reflux esophagitis(RE), and to explore the feasibility and effectiveness of esophageal stent implantation.MethodsThirty SD rats were randomly divided into the model group and control group. The rats in model group were treated by esophageal stent implantation: a steel ring was fixed on a sheath and pushed from the mouth to the cardia through esophagus, and then it was fixed with fish line suturing. The rats in control group were treated by esophageal balloon dilatation: a balloon was inserted along the guide wire into esophagus and localized in the gastroesophageal junction, then the balloon was inflated to maintain 10 minites. After operation, nursing observation and weight measurement were carried out on the animals, and the pathological changes of the esophageal specimens were obtained after 4 weeks.ResultsThe pathological examination showed that both two groups had obvious pathological changes in esophagus. Pathological changes and inflammatory lesions, especially in the lower esophagus, were obviously observed in the esophageal mucosa of the rats. And the pathological changes in the model group were more serious than that in the control group, while, the model group had a low survival rate.ConclusionUsing esophageal stent implantation could successfully produce the rat model of RE, which has the features of significant pathological changes in esophagus, relatively simple operation and light trauma with the rats, showing that the modeling method is feasible and worth popularization.

【Keywords】 Rat model; Reflux esophagitis; Esophageal interventional therapy; Stent implantation

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是胃內(nèi)容物反流入食管、口腔(包括喉部)或肺所致的癥狀和并發(fā)癥。酸(堿)反流導(dǎo)致的食管黏膜破損稱為反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)。近年來，隨著國內(nèi)外對RE發(fā)病原因和機制的相關(guān)研究不斷深入，RE動物模型的研究成為目前研究的一個熱點。廖旭等應(yīng)用食管氣囊擴張微創(chuàng)方法建立GERD動物模型，探索食管下括約肌(low esophageal sphincter,LES)松弛發(fā)病的機制，然而成功率偏低。王斌等在廖旭的基礎(chǔ)上改用Forley導(dǎo)尿管建立兔RE模型，不足之處為擴張強度較難把握。有學(xué)者[5-7]探索破壞LES及其周圍解剖組織的方法造成GERD，采用部分賁門肌切開加幽門半縫扎術(shù)制備RE動物模型。有學(xué)者[8]探索采用不同幽門管徑限制幽門舒張合并前胃結(jié)扎以限制胃容量的方法制作RE模型，探討不同的幽門結(jié)扎內(nèi)徑大小對RE模型的存活率、食管炎發(fā)生率的影響。另有學(xué)者[9]采用食管十二指腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)疊加夾尾刺激法所形成的RE大鼠動物模型制備方法，發(fā)現(xiàn)模型質(zhì)量及病變形成率高，術(shù)后動物并發(fā)癥及死亡率相對較小。為了探索安全有效的動物模型制備方法，本研究在借鑒以往RE動物模型制作方法的基礎(chǔ)上，擬通過經(jīng)食管植入金屬支架的技術(shù)手段，擴張動物食管下端，來制作RE的大鼠模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物12～13月齡清潔級SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK桂2009-0002。實驗動物使用許可證：SYKG桂2009-2005。

1.2實驗方法大鼠購回后，適應(yīng)環(huán)境7 d，于手術(shù)前禁食24 h，手術(shù)前采用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，劑量為0.3 ml/100 g。

1.2.1 模型組：麻醉后將大鼠置于手術(shù)臺，開腹后，將鋼圈(鋼絲直徑0.31 mm，鋼圈內(nèi)徑0.35 cm，長0.5～0.6 cm)套在鞘芯上，從口腔經(jīng)食管送鋼圈于賁門處，先退出鞘芯，再退出鞘，用魚線(0.4號，0.10 mm)縫合固定鋼圈于賁門處，關(guān)腹前腹腔內(nèi)注入青霉素105單位。如圖1所示，開腹后，仔細(xì)鈍性分離周圍神經(jīng)及血管，切勿損傷血管神經(jīng)，利用止血鑷分開充分暴露食管后，鑷子夾住大鼠下牙后將頭部抬起使口腔跟食管成一直線，利于將套有鋼圈的鞘管經(jīng)食管送進(jìn)賁門，分別退出鞘心和鞘，使鋼圈進(jìn)到賁門處，用魚線縫合固定鋼圈于賁門處，逐層關(guān)腹即可。

圖1 模型組大鼠構(gòu)建RE的步驟

A：鈍性分離周圍的靜脈和神經(jīng)；B：充分暴露食管；C：將套有鋼圈的鞘管經(jīng)食管送進(jìn)賁門；
D：退出鞘心和鞘；E：鋼圈進(jìn)到賁門處；F：魚線縫合固定鋼圈

Fig1ThestepsofconstructingREinmodelgroup

A: blunt separation of the surrounding veins and nerves; B: full exposure of the esophagus; C: the sheath with a steel ring was sent through the esophagus into the fontanelle; D: withdrawal sheath; E: steel ring entered the fontanelle; F: suture thread fixing steel ring

1.2.2 對照組：麻醉后將大鼠置于手術(shù)臺，插管前仔細(xì)檢查單腔管確無漏氣后，抽盡氣囊內(nèi)氣體，涂液體石蠟后，經(jīng)口腔插管送至賁門處，距離口腔約9 cm，緩慢向氣囊內(nèi)加壓至50 mmHg，維持10 min，重復(fù)3次，每次間隔3 min。對于一次擴張無效的動物還可以進(jìn)行多次重復(fù)擴張。圖2為X射線下的大鼠，球囊順利進(jìn)入賁門處后加壓擴張。

1.3術(shù)后觀察術(shù)后禁食24 h、不禁水，密切觀察模型組和對照組大鼠飲食、排便及活動情況，每周測量體質(zhì)量1次。對死亡動物隨即行尸體解剖，觀察胸腹腔臟器大體改變，以對其死因作出分析判斷。

圖2 對照組氣囊擴張賁門后的大鼠 Fig 2 Rats after balloon dilation in control group

1.4X線檢測大鼠鋼圈脫落情況對模型組大鼠在植入鋼圈術(shù)1周后開始進(jìn)行X線拍攝，觀察鋼圈在大鼠胃腸道的位置。

1.5病理檢查4周后，處死大鼠，取食管中下段組織置于質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后，用光鏡觀察組織學(xué)病理改變。

2 結(jié)果

2.1一般情況兩組大鼠毛發(fā)光亮，精神清醒，體質(zhì)量220～250 g，飲食正常，活動良好，其中模型組腹部可見2.5～3 cm長的傷口，在4周后逐漸消退，傷痕也逐漸消失。模型組在實驗過程中，術(shù)中因穿孔死亡1只，術(shù)后死亡2只，死亡率為20.00%，對照組術(shù)中無死亡，術(shù)后死亡1只，死亡率為6.67%，對照組存活率較模型組高。

2.2模型組大鼠鋼圈脫落情況經(jīng)X線拍攝發(fā)現(xiàn)，有少量大鼠的鋼圈從第2周開始出現(xiàn)脫落，至第3周出現(xiàn)大量脫落，第4周幾乎全部脫落。其中可見少量鋼圈脫落至胃部(見圖3～4)。

2.3食管下段病理模型組：造模4周后，病理顯示可分為3度：輕度者至重度者鱗狀上皮增生，黏膜固有層延長，炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤。

中度者較前加重并伴有固有層組織輕度充血出血和水腫，伴有糜爛。重度者較前加重，可見鱗狀上皮乳頭狀增生，炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量嗜酸性粒細(xì)胞)灶性浸潤加重，可見多核巨細(xì)胞及小灶壞死，糜爛程度加重。對照組：造模4周后，病理顯示，輕度炎癥者鱗狀上皮增生，固有層乳頭延伸，食管肌層彌漫性炎。中重度者可見食管肉芽腫性炎及水腫，小灶壞死，大量炎癥細(xì)胞(泡沫細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤(見圖5)。

圖3 鋼圈在賁門部；圖4 鋼圈在胃部Fig 3 Steel rings in the cardiac area; Fig 4 Steel rings in the stomach

圖5 食管病理圖片(HE 100×)

A：正常食管；B：模型組；C：對照組

Fig5Pathologyofesophagus(HE100×)

A: normal esophagus; B: model group; C: control group

3 討論

RE的病理機制復(fù)雜，要制備病變形成率高、死亡率低、模型長久穩(wěn)定、方法簡單易行的動物模型，是相關(guān)科學(xué)實驗有待解決的一個難點。與大動物模型相比，大鼠模型具有經(jīng)濟性、可重復(fù)性、實驗條件易控制、可大規(guī)模進(jìn)行等優(yōu)點。但大鼠RE模型的建立是一項手術(shù)要求相對較高的實驗技術(shù)方法，要建立一個穩(wěn)定的動物模型并不是一件容易之事，必須經(jīng)過較長時間的探索和訓(xùn)練才能完成。

抗反流屏障的結(jié)構(gòu)和功能缺陷是造成GERD的原因之一，本次實驗?zāi)康氖墙档蚅ES壓力，造成以胃酸為主的反流。實驗結(jié)果表明，采用介入的方法建立模型，可以減少胃的創(chuàng)傷；在賁門處置入鋼圈，可造成大鼠模型以中下段為主的食管組織病理有較明顯的炎癥改變，且存活率較高，表明該造模方法具有較強的可行性和推廣價值。

總結(jié)本次RE的造模實驗，有以下經(jīng)驗和教訓(xùn)供大家參考：

術(shù)前準(zhǔn)備：為保證手術(shù)順利進(jìn)行，大鼠術(shù)前24 h禁食而不禁水，可使大鼠胃腸道排空，利于視野暴露及手術(shù)吻合，防止感染，否則胃內(nèi)容物易從食管傷口滲出，造成腹腔感染導(dǎo)致大鼠死亡。

麻醉控制：對于建立動物模型而言，良好麻醉效果是做好手術(shù)的第一關(guān)。我們采用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛，起效快、麻醉效果較好，水合氯醛具有實用、價格便宜的特點，且毒性小，對大鼠毒性損傷較少。大鼠麻醉劑量為0.3 ml/100 g水合氯醛，若麻醉劑量不足，術(shù)中可出現(xiàn)大鼠不停掙扎，嚴(yán)重者造成組織損傷，使手術(shù)無法順利進(jìn)行。麻醉時為避免扎到腹腔臟器，抓住大鼠耳朵和頸部的皮膚，把大鼠的尾巴壓在無名指下，捏緊將大鼠提起來，暴露腹部，斜45°進(jìn)針，不可粗魯或大力進(jìn)針，極易扎傷腹部臟器，造成感染或死亡。待到有落空感后，回抽針管，觀察是否有血，再進(jìn)行注射。

術(shù)中注意事項：大鼠食管有3個狹窄處，鞘管經(jīng)食管送進(jìn)去的時候注意溫柔小心，切記捅傷食管，嚴(yán)重者捅破食管進(jìn)去胸腔，引起肺部感染。若感覺進(jìn)去困難，可用潤滑油或石蠟油涂擦鞘管，可使阻力減小。其次，固定線不僅要細(xì)小而且要耐腐蝕，鋼圈在賁門部要縫合固定3～4次，線頭要剪短又防止過短脫落。本次實驗需要改進(jìn)之處為可以采用更加耐腐蝕耐酸的縫合線，改進(jìn)損傷更小、固定更牢靠的鋼圈縫合方式，其食管炎癥可能會更嚴(yán)重，且模型維持時間可能會更久。第三，腹部術(shù)口切記過大，術(shù)口為2.5～3 cm，若大鼠本身胃體較大，可視情況調(diào)整術(shù)口大小?？p合腹部傷口時要全層吻合，利于痊愈和防止感染。若縫合質(zhì)量不高，不嚴(yán)密，可導(dǎo)致感染或術(shù)后腹部疝氣等。若食管術(shù)口縫合不緊密可能會導(dǎo)致胃液滲出到腹腔，造成腹腔感染導(dǎo)致死亡，若腹部術(shù)口縫合不緊密可能會導(dǎo)致感染或腹部疝氣等并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡。

抗感染：大鼠的耐受力較好，能夠抵抗一定的感染。但由于進(jìn)行手術(shù)后，大鼠易受感染死亡，術(shù)后應(yīng)予一定劑量的抗生素，可有效減少腹部切口、賁門縫合固定處的感染幾率。在預(yù)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腹部切口因感染而紅腫，大鼠撕咬縫線造成腹部切口開裂，腸管暴露而至死亡。若未能在無菌環(huán)境下進(jìn)行手術(shù)，可考慮術(shù)前予大鼠抗生素，術(shù)后維持3 d的抗生素。

術(shù)后大鼠復(fù)溫：冬季術(shù)后復(fù)溫尤為重要，術(shù)后給予大鼠烤燈復(fù)溫，皮毛烘干2～3 h，視具體情況而定。大鼠約1 h后清醒，能翻身爬起活動，但行動遲緩、無目標(biāo)，精神較差，對外界刺激淡漠，飲水量較少。待神志清醒，活躍走動時即可撤除烤燈。術(shù)后禁食24 h，不禁水。

術(shù)后恢復(fù)情況：模型組大鼠造模創(chuàng)傷較小，食管炎癥較為長久，然而大鼠有自愈機制，我們觀察到大鼠2～3個月后食管炎癥能自行恢復(fù)，但仍有傷口疤痕存在。對照組的食管炎癥持續(xù)時間較模型組短，能持續(xù)約2個月。我們觀察到大鼠食管中下段炎癥在第3～4周最嚴(yán)重，也是鋼圈脫落最密集的時間，由于大鼠的耐受力較好，自身修復(fù)能力較強，炎癥程度會得到不同程度的緩解，推測大鼠維持GERD模型時間為2～3個月。

本實驗建立在參考心臟支架手術(shù)之上，由于食管管道跟心血管管道相似，食管具有彈性與收縮性，鋼圈擴張食管，降低LES壓力，造成胃酸反流而形成RE動物模型，本實驗需要改進(jìn)之處為若找到類似心血管支架的材料替代鋼圈，可減少食管縫合創(chuàng)傷及腹部創(chuàng)傷，降低感染風(fēng)險，提高動物生存率，同時可延長食管炎癥時間，不會導(dǎo)致鋼圈脫落，若能找到此種材料替代，且價錢便宜，則能進(jìn)一步完善該實驗造模方法。

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