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1.德陽市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 德陽 618000； 2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Helicobacter pylori (H.pylori) on gastric epithelial cell cycle and autophagy.MethodsGES-1 cells were treated withH.pylori, flow cytometry was used to detect cell apoptosis and cell cycle, cell proliferation was detected by MTT, Western blotting was used to detect protein LC3 Ⅱ, Beclin 1, apoptosis protein Bcl-2, CDK4 and Cyclin D1 expression levels.ResultsGES-1 cellsAvalue afterH.pylorifrom 0.41±0.03 increased to 0.62±0.05, the apoptosis rate from (5.25±0.47)% increased to (10.32±1.23)%, the proportion of cells in S phase from (26.47±2.45)% increased to (41.66±4.37)%, cell autophagy protein LC3 Ⅱ, Beclin 1 were increased, Bcl-2 protein was decreased, the levels of CDK4 and Cyclin D1 proteins were increased. Compared with normal cells without treatment, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionH.pyloripromotes cell proliferation and apoptosis, the cell cycle is arrested in S phase, promoting autophagy.

【Keywords】 Helicobacter pylori; Gastric epithelial cell; Cell cycle; Autophagy

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是慢性胃炎、消化性潰瘍等發(fā)生的主要原因，且與胃癌的發(fā)生有關(guān)，H.pylori是人類重要的致癌因子，最初可以引起慢性非萎縮性胃炎，進而導(dǎo)致腸上皮化生，形成胃癌，根除H.pylori可以降低胃癌患病風(fēng)險，在中國，約50%的人有不同程度的H.pylori感染[1-2]。研究[3-4]顯示，H.pylori可以損傷胃黏膜上皮細胞，在H.pylori陽性患者的胃黏膜細胞中發(fā)現(xiàn)其增殖細胞核抗原增加，而胃黏膜上皮細胞過度增殖是發(fā)生癌變的重要病理學(xué)變化。自噬是細胞程序性死亡中的一種，在細胞受到病原微生物感染時，自噬也可以發(fā)揮免疫防御的作用，清除病原菌，在H.pylori感染的胃黏膜組織中，細胞自噬水平增加[5-6]。本研究以胃黏膜上皮細胞GES-1為研究對象，用H.pylori處理，探討H.pylori對胃黏膜上皮細胞增殖、凋亡、細胞周期和自噬的影響，為以后通過調(diào)控細胞自噬、凋亡及增殖等途徑預(yù)防H.pylori感染性疾病的發(fā)生提供參考。

1 材料與方法

1.1材料胃黏膜上皮細胞GES-1購自中國科學(xué)院細胞庫，H.pyloriATCC 43504標準菌株由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院保存。B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體為美國CTS產(chǎn)品；細胞周期依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)抗體為美國Santa Cruz產(chǎn)品；Beclin 1抗體、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體為美國Abacm產(chǎn)品；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)抗體為英國Viva Bioscience產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)凋亡檢測試劑盒為北京索萊寶產(chǎn)品；胰蛋白酶、DMEM為美國Sigma產(chǎn)品；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒為北京TIANGEN產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)GES-1細胞從液氮中取出后，將凍存管置于37 ℃的水浴中溶解完全，將細胞轉(zhuǎn)移至離心管，加入2 ml質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，混合后，在室溫，1 000 r/min，離心半徑為6 cm，離心5 min。吸除上清液后，加入5 ml細胞培養(yǎng)液，混合后，接種到25 ml的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)為：飽和濕度，37 ℃，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱。當細胞培養(yǎng)密度達到80%以后，倒掉原來的培養(yǎng)液上清，加入2 ml的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次細胞。加入2 ml含有質(zhì)量濃度為0.2 g/L EDTA和2.5 g/L的胰蛋白酶消化液，37 ℃孵育2 min。加入3 ml的細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心10 min。吸除上清液，加入3 ml的細胞培養(yǎng)液，以1∶3的比例種植到細胞瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細胞處理及分組GES-1細胞用不含有抗生素的質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。用H.pylori標準菌株感染復(fù)數(shù)(MOI=200)處理細胞，記為實驗組，同時以不加入H.pylori的細胞為對照組，培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.4MTT檢測細胞增殖GES-1細胞種植到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入5 000個細胞，按照1.3中方法處理實驗組和對照組細胞，每組設(shè)置4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，在每孔中加入20 μl的MTT溶液，37 ℃孵育4 h。把培養(yǎng)液吸除后，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，反應(yīng)10 min。檢測每孔490 nm的吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡對照組和實驗組細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h后，將細胞培養(yǎng)液吸除、胰蛋白酶消化后，收集各組細胞，用4 ℃的PBS洗滌2次后，將細胞濃度調(diào)整為2×106ml-1，吸取1 ml細胞，離心。加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，在避光條件下結(jié)合20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期對照組和實驗組細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h后，將細胞培養(yǎng)液吸除、胰蛋白酶消化后，收集各組細胞，用4 ℃的PBS洗滌2次后，將細胞濃度調(diào)整為2×106ml-1細胞。吸取1 ml細胞，離心，取細胞沉淀，加入1 ml的低滲檸檬酸標記液，混勻后，在4 ℃放置30 min，離心后，吸除上清液后，加入200 μl的緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7Westernblotting檢測LC3Ⅱ、Beclin1、Bcl-2、CDK4、CyclinD1水平對照組和實驗組細胞按照上述方法培養(yǎng)24 h后，把細胞培養(yǎng)液吸除，用2 ml的PBS洗滌2次細胞，按照每個25 ml細胞培養(yǎng)瓶加入500 μl裂解液，在4 ℃裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。收集蛋白上清液，用BCA法對蛋白進行定量檢測。配制質(zhì)量濃度為100 g/L的分離膠和質(zhì)量濃度為50 g/L的濃縮膠。把蛋白樣品與4×SDS-PAGE上樣緩沖液以體積比為3∶1的比例混勻后，在100 ℃煮沸5 min。每孔加入30 μg的蛋白樣品，以90 V恒壓電泳，觀察溴酚藍到分離膠的底部時停止電泳。200 mA將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，轉(zhuǎn)膜時間為2 h。NC膜置于質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中，4 ℃封閉過夜。NC膜放在1∶1 000稀釋的一抗中，37 ℃孵育2 h后，用TBST(Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween)在室溫洗滌3次。將NC膜放在1∶3 000稀釋的二抗中，37 ℃孵育2 h。同樣用TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光，Image Lab曝光，用Bio-Rad分析條帶灰度值。用目的條帶灰度值除以GAPDH灰度值表示蛋白水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1細胞增殖凋亡檢測結(jié)果對照組和實驗組細胞A值分別為：0.41±0.03、0.62±0.05，細胞凋亡率依次為：(5.25±0.47)%、(10.32±1.23)%。實驗組A值和細胞凋亡率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=6.238，t2=6.669，P<0.05，見圖1)。H.pylori促進胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡。

圖1 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Fig 1 Cell apoptosis detected by flow cytometry

2.2細胞周期檢測結(jié)果實驗組G0/G1期細胞明顯低于對照組，而S期細胞明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。H.pylori將胃黏膜上皮細胞周期阻滯在S期(見表1)。

2.3自噬蛋白LC3Ⅱ、Beclin1檢測結(jié)果對照組和實驗組LC3 Ⅱ水平為：0.41±0.03、0.95±0.11，Beclin 1水平為：0.36±0.03、1.04±0.12。實驗組LC3Ⅱ、Beclin 1的表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=8.203，t2=9.522，P<0.05)(見圖2)。表明H.pylori促進胃黏膜上皮細胞自噬。

表1 各組細胞周期變化Tab 1 Changes of cell cycle %

注：與對照組相比，t=6.890，t=5.252，*P<0.05；與對照組相比，t=5.252，#P>0.05。

圖2 Western blotting檢測細胞中自噬蛋白LC3Ⅱ、

2.4Bcl-2、CDK4、CyclinD1水平檢測結(jié)果實驗組Bcl-2表達水平明顯低于對照組，而CDK4、Cyclin D1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、表2)。表明H.pylori抑制胃黏膜上皮細胞中Bcl-2表達，促進CDK4、Cyclin D1表達。

圖3 Western blotting檢測Bcl-2、CDK4、Cyclin D1水平Fig 3 Levels of Bcl-2, CDK4, Cyclin D1 detected byWestern blotting

注：與對照組相比，t=12.222，t=9.700，t=12.394，*P<0.05。

3 討論

研究[7]顯示，H.pylori感染與胃癌的發(fā)病率呈正相關(guān)，H.pylori感染者發(fā)生胃癌的概率是非感染者的6倍左右。在胃癌發(fā)生過程中，細胞過度增殖，而隨著細胞增殖速度的加快，細胞發(fā)生DNA復(fù)制錯誤等的機會增加，基因突變的概率升高，細胞惡性增殖的速度也會增加[8]。從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎，再到腸上皮化生、異型增生等這一系列過程中，胃黏膜上皮細胞的增殖速度不斷加快，也是胃癌發(fā)生的標志之一[9]。

在正常情況下，細胞的增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)，細胞增殖加快時，細胞凋亡減少。但在H.pylori感染的患者中，胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡速度均增加[10]。研究[3-4，11]顯示，在H.pylori感染的大鼠模型中，胃黏膜組織中的細胞凋亡速度增加，組織中增殖細胞核抗原的陽性率升高。本研究用H.pylori處理胃黏膜上皮細胞，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖能力增加，細胞凋亡水平也增加，說明H.pylori可以誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡。

細胞周期可以分為間期、分裂期，其中G1期、S期和G2期組成間期，M期是細胞分裂期[12]。調(diào)控細胞周期的因素有很多，與細胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄等有關(guān)[13]。細胞周期性蛋白(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)等是調(diào)控細胞周期的重要因子，Cyclin D1和CDK4可以形成復(fù)合物，促進S期相關(guān)基因的表達，促進細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化[14]。本研究結(jié)果顯示，H.pylori處理后的胃黏膜上皮細胞S期細胞比例增加，細胞中Cyclin D1和CDK4水平升高，說明H.pylori可以促進細胞中Cyclin D1和CDK4表達，從而將周期阻滯在S期。

自噬是細胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過合成新的蛋白質(zhì)，把原來異常或老化的蛋白降解掉的過程，是一種進化較為保守的溶酶體依賴的降解途徑[15]。正常情況下，自噬對細胞穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用，而在病理因素的作用下，自噬還與腫瘤發(fā)生、老年癡呆、細菌感染、帕金森、免疫相關(guān)疾病等的發(fā)生有關(guān)[16-18]。Beclin-1在自噬分隔膜形成的早期作為一種平臺分子，可以調(diào)控磷脂酰肌醇等復(fù)合物的形成，此外，Beclin-1還可以與Bcl-2蛋白結(jié)合，抑制自噬發(fā)生，而Bcl-2作為一種重要的凋亡相關(guān)蛋白，參與調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生[19-20]。LC3Ⅱ是細胞自噬的標志蛋白，LC3的C端甘氨酸殘基暴露形成LC3Ⅱ[20-22]。本研究結(jié)果顯示，H.pylori作用后的胃黏膜上皮細胞中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白水平升高，Bcl-2水平降低，細胞自噬水平升高。

綜上，H.pylori促進胃黏膜上皮細胞增殖、凋亡，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞自噬，導(dǎo)致胃黏膜不穩(wěn)定，這可能是其促進胃癌發(fā)生的原因。本研究結(jié)果為研究H.pylori在胃癌發(fā)生中的作用提供了理論參考，為研究其作用機制奠定了基礎(chǔ)。

[1] MYINT T, SHIOTA S, VILAICHONE R K, et al. Prevalence of Helicobacter pylori infection and atrophic gastritis in patients with dyspeptic symptoms in Myanmar [J]. World J Gastroenterol, 2015, 21(2): 629-636. DOI: 10.3748/wjg.v21.i2.629.

[2] CHEN X Z, SCH?TTKER B, CASTRO F A, et al. Association of helicobacter pylori infection and chronic atrophic gastritis with risk of colonic, pancreatic and gastric cancer: A ten-year follow-up of the ESTHER cohort study [J]. Oncotarget, 2016, 7(13): 17182-17193. DOI: 10.18632/oncotarget.7946.

[3] 朱立寧, 徐岷, 張尤歷, 等. 不同基因型幽門螺桿菌對人胃黏膜上皮細胞引起免疫損傷的作用[J]. 國際消化病雜志, 2016, 36(1): 63-65. DOI: 10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.016.

[4] BYUN E, PARK B, LIM J W, et al. Activation of NF-κB and AP-1 mediates hyperproliferation by inducing β-catenin and c-Myc in Helicobacter pylori-infected gastric epithelial cells [J]. Yonsei Med J, 2016, 57(3): 647-651. DOI: 10.3349/ymj.2016.57.3.647.

[6] HOLCK S, HOLM I L, HOLCK P P, et al. Epithelial cell kinetics of the gastric mucosa during Helicobacter pylori infection [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2007, 50(2): 206-212. DOI: 10.1111/j.1574-695X.2007.00254.x.

[7] LEE Y C, CHIANG T H, CHOU C K, et al. Association between Helicobacter pylori eradication and gastric cancer incidence: a systematic review and Meta-analysis [J]. Gastroenterology, 2016, 150(5): 1113-1124.e5. DOI: 10.1053/j.gastro.2016.01.028.

[8] SAKA A, YAGI K, NIMURA S. Endoscopic and histological features of gastric cancers after successful Helicobacter pylori eradication therapy [J]. Gastric Cancer, 2016, 19(2): 524-530. DOI: 10.1007/s10120-015-0479-y.

[9] 張衛(wèi)民, 賴卓勝, 許剛, 等. 幽門螺桿菌源抗菌肽對胃黏膜上皮細胞及胃癌細胞生長的影響[J]. 中華消化雜志, 2003, 23(12): 715-717. DOI: 10.3760/j.issn:0254-1432.2003.12.003.

ZHANG W M, LAI Z S, XU G, et al. In vitro effects of cecropin-like antibacterial peptide from Helicobacter pylori on gastric cancer cells and gastric epithelial cells [J].Chin J Dig, 2003, 23(12): 715-717. DOI: 10.3760/j.issn:0254-1432.2003.12.003.

[10] CRABTREE J E, COURT M, ABOSHKIWA M A, et al. Gastric mucosal cytokine and epithelial cell responses to Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils [J]. J Pathol, 2004, 202(2): 197-207. DOI: 10.1002/path.1498.

[11] LIU T, SHI Y, LIU X F, et al. Helicobacter pylori HP0876 is dispensable for heme-iron acquisition but attenuates bacterial adherence to gastric epithelial cells [J]. Curr Microbiol, 2012, 65(3): 254-261. DOI: 10.1007/s00284-012-0153-0.

[12] 馮少勇, 張雁鋼, 張利, 等. 細胞周期點激酶l/2的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2015, 9(10): 1916-1921. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2015.10.035.

FENG S Y, ZHANG Y G, ZHANG L, et al. Progress in the study of cell cycle checkpoint kinase 1/2 [J]. Chin J Clinicians (Electronic Edition), 2015, 9(10): 1916-1921. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2015.10.035.

[13] 尹淑杰, 張濤, 榮光影, 等. 川芎嗪對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和細胞周期蛋白E、P21表達的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2016, 36(20): 4961-4962. DOI: 10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009.

[14] HOSOOKA T, OGAWA W. A novel role for the cell cycle regulatory complex cyclin D1-CDK4 in gluconeogenesis [J]. J Diabetes Investig, 2016, 7(1): 27-28. DOI: 10.1111/jdi.12369.

[15] DUAN L, PEREZ R E, DAVAADELGER B, et al. p53-regulated autophagy is controlled by glycolysis and determines cell fate [J]. Oncotarget, 2015, 6(27): 23135-23156. DOI: 10.18632/oncotarget.5218.

[16] HOSSEINZADEH M, NIKSERESHT S, KHODAGHOLI F, et al. Cannabidiol post-treatment alleviates rat epileptic-related behaviors and activates hippocampal cell autophagy pathway along with antioxidant defense in chronic phase of pilocarpine-induced seizure [J]. J Mol Neurosci, 2016, 58(4): 432-440. DOI: 10.1007/s12031-015-0703-6.

[17] 徐俊杰, 王志蓮, 郝敏. 細胞自噬與腫瘤的研究進展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2016, 10(5): 701-706. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2016.05.021.

XU J J, WANG Z L, HAO M. Research progress of autophagy and tumor [J]. Chin J Clinicians (Electronic Edition), 2016, 10(5): 701-706. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2016.05.021.

[18] NIXON R A, YANG D S. Autophagy failure in Alzheimer’s disease-locating the primary defect [J]. Neurobiol Dis, 2011, 43(1): 38-45. DOI: 10.1016/j.nbd.2011.01.021.

[19] BASPINAR S, BIRCAN S, YAVUZ G, et al. Beclin 1 and bcl-2 expressions in bladder urothelial tumors and their association with clinicopathological parameters [J]. Pathol Res Pract, 2013, 209(7): 418-423. DOI: 10.1016/j.prp.2013.04.006.

[20] BASPINAR S, BIRCAN S, ORHAN H, et al. The relation of beclin 1 and bcl-2 expressions in high grade prostatic intraepithelial neoplasia and prostate adenocarcinoma: a tissue microarray study [J]. Pathol Res Pract, 2014, 210(7): 412-418. DOI: 10.1016/j.prp.2014.02.008.

[21] SAHNI S, BAE D H, LANE D J, et al. The metastasis suppressor, N-myc downstream-regulated gene 1 (NDRG1), inhibits stress-induced autophagy in cancer cells [J]. J Biol Chem, 2014, 289(14): 9692-9709. DOI: 10.1074/jbc.M113.529511.

[22] 謝敏, 郭燕君, 徐營, 等. 去血清饑餓法對卵巢顆粒細胞自噬因子LC3和Beclin-1表達的影響[J]. 中國婦幼保健, 2016, 31(5): 1045-1047. DOI: 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2016.05.59.

XIE M, GUO Y J, XU Y, et al. Effect of serum starvation on expressions of LC-3 and Beclin-1 in granulosa cells of ovary [J]. Maternal & Child Health Care of China, 2016, 31(5): 1045-1047. DOI: 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2016.05.59.

doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2018.06.017