黃驛勝 王競楓 林楓 李林立 葉啟文 林峰 張代場

Twist是一種轉錄調控因子，在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用[1]。最近的研究表明，Twist在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用，其在肺癌、胰腺癌、卵巢癌、膽管癌等癌組織中過度表達，干擾Twist后，癌細胞的生長受到抑制[2-3]。癌細胞能量代謝與正常細胞不同，主要以糖酵解形式供能，丙酮酸激酶、己糖激酶是糖酵解途徑中的關鍵限速酶，糖酵解過程中乳酸分泌增加。研究顯示，Twist能夠促進乳腺癌細胞能量代謝。蛋白質組學和mRNA芯片顯示，MCF10A-Twist細胞中與葡萄糖相關的基因發(fā)生了變化，Twist和Akt的啟動子可以相結合，增加其活化水平，影響Akt信號通路激活，而Akt信號通路的激活又參與腫瘤細胞糖酵解途徑[4-7]。本研究以胰腺癌PANC1細胞為研究對象，采用mRNA干擾方法抑制細胞Twist基因的表達，探討Twsit基因對胰腺癌細胞糖酵解及增殖的影響。

材料與方法

一、材料

RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶均為美國Sigma公司產品；新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品；陰性對照siRNA(siRNA-NC)和靶向Twist基因的siRNA(siRNA-Twist)為英國Abbexa公司產品；Twist、β肌動蛋白(β-actin)引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Twist多克隆抗體、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)多克隆抗體、磷酸化的Akt(p-Akt)多克隆抗體均為英國 abcam公司產品；細胞蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司產品；丙酮酸激酶活性檢測試劑盒、己糖激酶活性檢測試劑盒、乳酸含量檢測試劑盒均為北京Solarbio公司產品。

二、細胞培養(yǎng)及轉染

胰腺癌PANC1細胞購于中科院細胞庫。PANC1細胞培養(yǎng)用含有青霉素和鏈霉素各100 U/ml、10%新生牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞傳代用0.25%的胰蛋白酶消化，培養(yǎng)條件為飽和濕度，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

取對數(shù)生長期的PANC1細胞，接種于6孔板，每孔2×105個細胞，待細胞60%融合時，將培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，孵育60 min。應用脂質體方法將siRNA分別轉染PANC1細胞，按Lipofectamine2000試劑盒說明書操作，以未轉染細胞作為對照組。轉染6 h后更換為含有胎牛血清的培養(yǎng)液，轉染48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液。

三、Twist mRNA表達檢測

取上述轉染48 h的各組PANC1細胞，采用Trizol提取總RNA，先逆轉錄成cDNA，再行實時PCR檢測Twist mRNA表達。Twist正義序列為5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，反義序列為5′-GCTTGAGGGTCGAATCTTGCT-3′；內參β-actin正義序列為5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，反義序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。PCR反應條件：94℃ 120 s，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 120 s，30個循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，應用公式2-△△Ct計算Twist mRNA相對表達量，以對照組表達量為1。

四、Twist及Akt、p-Akt蛋白表達檢測

取上述3組培養(yǎng)48 h的對數(shù)生長期細胞，提取細胞蛋白，BCA定量后常規(guī)行蛋白質印跡法檢測細胞Twist、Akt、p-Akt蛋白表達水平。一抗工作濃度均為1∶800，二抗為1∶2 000。以目的條帶與β-actin條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

五、細胞增殖的檢測

取上述3組培養(yǎng)48 h的對數(shù)生長期細胞，以2×103/孔的密度接種至96孔培養(yǎng)板，每組設置7個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃孵育4 h，棄去上清液，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，震蕩反應10 min，上酶標儀檢測波長為490 nm處的吸光度值(A490值)，計算細胞存活率，同時以不加細胞的孔調零。細胞存活率=(實驗組A490值/對照組A490值)×100%。

六、丙酮酸激酶、己糖激酶活性檢測

上述3組細胞培養(yǎng)48 h后，檢測丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，按丙酮酸激酶和己糖激酶活性檢測試劑盒說明書操作。

七、乳酸分泌量檢測

上述3組細胞培養(yǎng)48 h后，取培養(yǎng)液上清，用乳酸含量檢測試劑盒檢測乳酸分泌水平。

八、統(tǒng)計學處理

結 果

一、轉染后PANC1細胞Twist基因表達

對照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組Twist mRNA表達量分別為1.00±0.09、1.01±0.08、0.36±0.02，蛋白表達量分別為0.41±0.05、0.42±0.04、0.12±0.06。siRNA-NC組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而siRNA-Twist組顯著低于對照組及siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，圖1)。

圖1 對照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-Twist組(3)Twist蛋白表達

二、轉染后PANC1細胞的存活率

培養(yǎng)48 h后，對照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組細胞存活率分別為(100.02±9.36)%、(100.01±10.25)%、(59.32±7.26)%。siRNA-NC組與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而siRNA-Twist組顯著低于對照組及siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

三、轉染后PANC1細胞的丙酮酸激酶、己糖激酶活性及乳酸含量

對照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組細胞的丙酮酸激酶活性分別為(0.73±0.05)、(0.72±0.08)、(0.43±0.05)U/mg，己糖激酶活性分別為(4.98±0.48)、(4.96±0.52)、(2.54±0.21)U/mg，乳酸含量分別為(20.36±2.61)、(20.64±3.05)、(9.48±1.09)mmol/L。siRNA-NC組丙酮酸激酶、己糖激酶活性及乳酸含量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，siRNA-Twist組較對照組及siRNA-NC組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

四、轉染后PANC1細胞Akt、p-Akt蛋白表達

對照組、siRNA-NC組和siRNA-Twist組p-Akt/Akt蛋白比值分別為0.65±0.04、0.63±0.07、0.25±0.04。siRNA-NC組p-Akt/Akt比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-Twist組較對照組及siRNA-NC組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，圖2)。

圖2 對照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-Twist組(3)組Akt、p-Akt表達

討 論

Twist是一種高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋家族的成員之一，由1個內含子和2個外顯子組成，其編碼的蛋白由202個氨基酸組成，在胚胎發(fā)育的早期發(fā)揮調控作用[8]。近年研究表明，Twist參與腫瘤的發(fā)生，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移等有關[9]。Ohuchida等[10]研究顯示，Twist在胰腺癌中表達上調，且Twist蛋白表達水平與淋巴結分期有關，與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度無關。張娟等[11]通過干擾結腸癌細胞Twist表達后發(fā)現(xiàn)，下調Twist能夠體外抑制結腸癌細胞的增殖并減弱結腸癌細胞裸鼠成瘤能力。Wang等[12]報道，干擾宮頸癌細胞Twist表達24 h后對細胞的生長抑制率超過25%。這些研究結果均提示，Twsit下調后能抑制癌細胞的增殖。本研究結果顯示，干擾Twist表達后胰腺癌細胞的存活率下降，細胞增殖能力降低，與文獻報道相符。

癌細胞與正常細胞不同，其在氧氣充足的情況下也以糖酵解的方式提供能量，這種方式也被稱為Warburg效應[13]。糖酵解過程中，葡萄糖和糖原分解成丙酮酸，在此過程中伴有ATP的產生，己糖激酶是首個限速酶，而丙酮酸激酶調控糖酵解有氧氧化的轉化[14]。有研究表明，己糖激酶、丙酮酸激酶在腫瘤組織中廣泛表達[15]。乳酸是糖酵解的最終產物，檢測乳酸含量是評價糖酵解水平的重要方法。Chen等[16]研究表明，乳腺癌細胞中丙酮酸激酶、己糖激酶含量升高，乳酸分泌量增加。本研究結果顯示，干擾Twist后胰腺癌細胞中丙酮酸激酶、己糖激酶活性降低，乳酸分泌量減少，提示干擾Twist能夠抑制胰腺癌細胞的糖酵解。

Akt信號通路與細胞的生長、能量代謝等有關，在多種組織和器官中均發(fā)揮調控作用。Akt磷酸化后，其信號通路激活，從而發(fā)揮促進細胞增殖的作用[17]。Cao等[18]的研究表明，抑制Akt信號通路后，胃癌細胞的增殖能力降低。Yang等[19]的研究表明，miRNA-21能夠通過影響Akt信號通路調控膀胱癌細胞糖酵解。本研究結果顯示，干擾Twsit能夠下調p-Akt的水平從而影響胰腺癌細胞的增殖和糖酵解。

參 考 文 獻

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