朱建偉 孔祥毓 孔凡揚(yáng) 朱惠云 安薇 吳洪玉 李兆申 金震東

細(xì)胞色素450(cytochrome 450，CYP450)是一大類廣泛存在的含有一個(gè)鐵原卟啉Ⅸ血紅素的蛋白，與化療藥物耐藥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[1]。CYP3A5是CYP450酶超家族中的一員，多篇研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5多態(tài)性與腫瘤易感性及藥物代謝相關(guān)[2-4]，然而對于CYP3A5在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究較少。此外，CYP3A5在不同腫瘤中的作用也不同，它在前列腺癌中表現(xiàn)為癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[5]；在肝癌細(xì)胞中則表現(xiàn)為抑癌基因，抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]；在胰腺癌中可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞耐藥[7]。本課題組通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)CYP3A5在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)增高，提示其可能為癌基因，為此本研究觀察CYP3A5基因表達(dá)量的變化對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響，探討其潛在機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及選擇

胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、FG、MDA28、8902、PANC1均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測5株胰腺癌細(xì)胞系CYP3A5蛋白表達(dá)量，選取CYP3A5表達(dá)較高及較低的2株細(xì)胞系用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

二、靶向CYP3A5的過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，使細(xì)胞鋪滿各孔面積的50%，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將靶向CYP3A5的過表達(dá)質(zhì)粒(pLenti-h-CYP3A5-V5-Blast)轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，以空載質(zhì)粒(pLenti-CMV-V5-Blast)轉(zhuǎn)染作為對照，質(zhì)粒購于上海亞載生物公司。將3條靶向CYP3A5的siRNA(siRNA-CYP3A5)轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染不針對任何靶基因的非特異性siRNA(siRNA-NC)作為對照。3條siRNA-CYP3A5購自Sigma公司，序列分別為5′-CCUUGAAAUUAGACACGCATT-3′、 5′-GAGUUAUUCUAAGGAUUUCUACUTT-3′、5′-GGAAGAGAAUACGGUCAUUTT-3′。siRNA-NC序列為5′-UUCUCACCGCGAAUGUCGUTT-3′。以抑制效率最佳的siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、胰腺癌細(xì)胞增殖能力的檢測

1．增殖實(shí)驗(yàn)：分別取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染CYP3A5過表達(dá)質(zhì)粒、空載質(zhì)粒的PANC1細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染siRNA-CYP3A5、siRNA-NC的BxPC-3細(xì)胞(2 000個(gè)/100 μl)接種96孔板，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后分別培養(yǎng)24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)時(shí)每孔加入10 μl CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1 h，上酶標(biāo)儀測定各孔在波長為450 nm處的吸光度值(A450值)，取均值。

2．克隆形成實(shí)驗(yàn)：取上述各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)液，500個(gè)細(xì)胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，每隔3 d換培養(yǎng)液，培養(yǎng)結(jié)束后加入甲醇固定細(xì)胞30 min，加入2 ml 0.1%的結(jié)晶紫染色1 h，吸出結(jié)晶紫，空氣干燥后用肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

四、胰腺癌細(xì)胞CYP3A5、cyclin D1、Bcl-2及cyclin E的蛋白表達(dá)檢測

使用RIPA緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)，以α-tublin、actin作為內(nèi)參。兔抗人CYP3A5、cyclin D1、Bcl-2抗體均以1∶1 000稀釋，羊抗兔二抗1∶2 000稀釋，鼠抗人cyclin E 1∶1 000稀釋，羊抗鼠二抗1∶2 000稀釋。最后使用ECL顯示免疫反應(yīng)性條帶，應(yīng)用Image J軟件掃描。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量，且將空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或siRNA-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白相對表達(dá)量標(biāo)化為1。CYP3A5抗體購于Proteintech公司，cyclin D1抗體購于Cell signaling technology公司，Bcl-2及cyclin E抗體購于Santa cruze公司。二抗購于西塘生物有限公司。

五、胰腺癌細(xì)胞cyclin D1 mRNA表達(dá)量檢測

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，上SYBR Green儀行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參。cyclin D1正義序列為5′-CCG-CCTCACACGCTTCCTCTC-3′，反義序列為5′-TCC-TCCTCGGCGGCCTTGGGG-3′；GAPDH正義序列為5′-TGCACCACCAACTGCTTA-3′，反義序列為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAC-3′。引物由捷瑞公司合成。經(jīng)PCR儀自帶軟件獲取產(chǎn)物Ct值，通過2-ΔΔCT公式計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，且將空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或siRNA-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞的mRNA表達(dá)量標(biāo)化為1。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的篩選及鑒定

BxPC-3、FG、MDA28、8902、PANC1 5株胰腺癌細(xì)胞的CYP3A5蛋白表達(dá)量分別為0.90、0.72、0.74、0.56、0.52，BxPC-3細(xì)胞的CYP3A5蛋白表達(dá)量最高，PANC1細(xì)胞的表達(dá)量最低(圖1)，因此選取上述2株細(xì)胞系行下一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3(1)、FG(2)、MDA28(3)、8902(4)、PANC1(5)的CYP3A5蛋白表達(dá)

CYP3A5過表達(dá)組、空載質(zhì)粒組PANC1細(xì)胞的CYP3A5蛋白表達(dá)量分別為1.66±0.14、1.00，過表達(dá)組顯著高于空載質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.1,P=0.0021，圖2)。

3個(gè)siRNA-CYP3A5轉(zhuǎn)染組的BxPC-3細(xì)胞CYP3A5蛋白表達(dá)量分別為0.44±0.032、0.38±0.037、0.18±0.02，較siRNA-NC轉(zhuǎn)染組的1.00顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.64、16.62、24.05，P值均<0.0001)。因siRNA3-CYP3A5的抑制效率最佳，因此選取siRNA3用于后續(xù)研究(圖2)。

圖2 空載質(zhì)粒組(1)、CYP3A5過表達(dá)組(2)PANC1細(xì)胞及siRNA-NC組(3)、3個(gè)siRNA-CYP3A5組(4～6)BxPC-3細(xì)胞的CYP3A5蛋白表達(dá)

二、上調(diào)CYP3A5表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖

CYP3A5過表達(dá)組與空載質(zhì)粒組PANC1細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的A450值分別為0.73±0.05與0.71±0.05、1.36±0.05與1.15±0.03、2.10±0.09與1.42±0.03，過表達(dá)組48、72 h時(shí)的A450值顯著高于空載質(zhì)粒組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.62，P=0.0067；t=6.92，P=0.0001)。

siRNA-CYP3A5轉(zhuǎn)染組與siRNA-NC轉(zhuǎn)染組BxPC-3細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 的A450值比較分別為0.44±0.03比0.45±0.02、0.62±0.01比0.77±0.03、0.83±0.01比1.18±0.02，siRNA-CYP3A5轉(zhuǎn)染組48、72 h時(shí)的A450值顯著低于siRNA-NC轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.5，P=0.0085；t=14.54，P<0.0001)。

過表達(dá)組PANC1細(xì)胞克隆形成率為(19.33±0.58)%，顯著高于空載質(zhì)粒組的(9.67±0.63)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.22，P=0.0004)；CYP3A5-siRNA組克隆形成率為(8.5±0.8)%，顯著低于siRNA-NC組的(16.0±0.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.35，P=0.0018，圖3)。

圖3 空載質(zhì)粒組(3A)、CYP3A5過表達(dá)組(3B)PANC1細(xì)胞及siRNA-NC組(3C)、siRNA-CYP3A5組(3D)BxPC-3細(xì)胞的克隆形成

三、CYP3A5通過上調(diào)cyclin D1蛋白表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖

過表達(dá)組PANC1細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)量為2.00±0.11，顯著高于空載質(zhì)粒組的1.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.043，P=0.0013)，而cyclin D1 mRNA表達(dá)量為1.06±0.01，與空載質(zhì)粒組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；siRNA-CYP3A5組BxPC-3細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)為0.45±0.04，顯著低于siRNA-NC組的1.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.95，P=0.0003)，而cyclin D1 mRNA表達(dá)量為1.09±0.03，與siRNA-NC組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。此外，過表達(dá)組PANC1細(xì)胞或siRNA-CYP3A5轉(zhuǎn)染組BxPC-3細(xì)胞的cyclin E及Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量與各自對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示上調(diào)或抑制CYP3A5表達(dá)僅在蛋白層面調(diào)節(jié)cyclin D1基因，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。

圖4 空載質(zhì)粒組(1)、CYP3A5過表達(dá)組(2)PANC1細(xì)胞及siRNA-NC組(3)、siRNA-CYP3A5組(4)BxPC-3細(xì)胞cyclin D1、cyclin E及Bcl-2蛋白的表達(dá)

討 論

前期對CYP3A5的研究主要集中于該基因與獲得性耐藥、基因多態(tài)性、外源性或內(nèi)源性基因的代謝及致癌物代謝之間的關(guān)系，表明CYP3A5的多態(tài)性與癌癥風(fēng)險(xiǎn)或腫瘤獲得性耐藥相關(guān)。

本課題組通過生物信息學(xué)方法對Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織CYP3A5 mRNA表達(dá)量上調(diào)，提示CYP3A5在胰腺癌中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。為了進(jìn)一步明確其作用，本研究通過RNA干擾技術(shù)對高表達(dá)CYP3A5的BxPC-3進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染以抑制CYP3A5表達(dá)，而通過CYP3A5過表達(dá)質(zhì)粒對低表達(dá)CYP3A5的PANC1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染以過表達(dá)CYP3A5。通過CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察胰腺癌細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，抑制CYP3A5表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，CYP3A5過表達(dá)能加快胰腺癌的增殖，表明CYP3A5作為癌基因在胰腺癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

腫瘤細(xì)胞增殖加快主要表現(xiàn)在其細(xì)胞周期失調(diào)和凋亡減少。cyclin D1是細(xì)胞周期G1期重要的正向調(diào)控基因，在多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，且其過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及患者生存期縮短密切相關(guān)[8-10]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)CYP3A5蛋白可上調(diào)cyclin D1蛋白表達(dá)，而抑制CYP3A5蛋白表達(dá)可下調(diào)cyclin D1蛋白表達(dá)，但均不影響CYP3A5 mRNA 的表達(dá)，推測CYP3A5蛋白是在轉(zhuǎn)錄后層面影響cyclin D1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Bruno RD, Njar VC. Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anti-cancer drug development[J]. Bioorg Med Chem, 2007, 15(15): 5047-5060. DOI:10.1016/j.bmc.2007.05.046.

[2] Diekstra MH, Swen JJ, Boven E, et al. CYP3A5 and ABCB1 polymorphisms as predictors for sunitinib outcome in metastatic renal cell carcinoma[J]. Eur Urol, 2015, 68(4): 621-629. DOI: 10.1016/j.eururo.

[3] Yeh KT, Chen JC, Chen CM, et al. CYP3A5*1 is an inhibitory factor for lung cancer in Taiwanese[J]. Kaohsiung J Med Sci, 2003, 19(5): 201-207.DOI:10.1016/S1607-551X(09)70425-5.

[4] Zhenhua L, Tsuchiya N, Narita S, et al. CYP3A5 gene polymorphism and risk of prostate cancer in a Japanese population[J]. Cancer Lett, 2005, 225(2): 237-243.DOI:10.1016/j.canlet.2005.03.009.

[5] Mitra R, Goodman OB, Jr. CYP3A5 regulates prostate cancer cell growth by facilitating nuclear translocation of AR[J]. Prostate, 2015, 75(5): 527-538. DOI: 10.1002/pros.22940.

[6] Jiang F, Chen L, Yang YC, et al. CYP3A5 functions as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma by regulating mTORC2/Akt signaling[J]. Cancer Res, 2015, 75(7): 1470-1481. DOI: 10.1158/0008-5472.

[7] Noll EM, Eisen C, Stenzinger A, et al. CYP3A5 mediates basal and acquired therapy resistance in different subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Nat Med, 2016,22(3):278-287. DOI: 10.1038/nm.4038.

[8] Diehl JA. Cycling to cancer with cyclin D1[J]. Cancer Biol Ther, 2002, 1(3): 226-231.

[9] Jares P, Colomer D, Campo E. Genetic and molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma: perspectives for new targeted therapeutics[J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(10): 750-762.

[10] Thomas GR, Nadiminti H, Regalado J. Molecular predictors of clinical outcome in patients with head and neck squamous cell carcinoma[J]. Int J Exp Pathol, 2005, 86(6): 347-363.DOI:10.1111/j.0959-9673.2005.00447.x.