陸德文 李先鵬 張波 姜玉華 許豐 郭世偉

胰腺癌化療敏感性低，容易產(chǎn)生耐藥性，因此探索其耐藥機(jī)制并尋求新的化療藥物對(duì)胰腺癌的治療具有重要的臨床意義[1-2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)是細(xì)胞內(nèi)高豐度的染色體結(jié)合蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤通過(guò)高表達(dá)HMGB1及其晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)適應(yīng)不利的微環(huán)境，包括能量和供氧壓力、機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊等[3-4]。本研究通過(guò)抑制胰腺癌耐吉西他濱細(xì)胞株HMGB1的表達(dá)，觀察其對(duì)吉西他濱敏感性的影響，并探討其可能機(jī)制。

材料與方法

一、耐吉西他濱胰腺癌PANC1細(xì)胞株的建立

人胰腺癌PANC1細(xì)胞株為鄞州人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室凍存，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。通過(guò)濃度梯度遞增誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法建立耐吉西他濱胰腺癌PANC1細(xì)胞株(PANC1-GR)，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，以5 μmol/L吉西他濱誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，去除死亡細(xì)胞后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，傳代后梯度增加吉西他濱濃度(10、20、30、50、75、100、150 μmol/L)繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。確定細(xì)胞能夠存活并穩(wěn)定傳代的最高吉西他濱濃度，以獲得PANC1-GR細(xì)胞株。

二、靶向HMGB1的siRNA轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1和PANC1-GR細(xì)胞，以5×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，采用脂質(zhì)體法將靶向HMGB1的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書操作。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別為siRNA-HMGB1-PANC1細(xì)胞及siRNA-HMGB1-PANC1-GR細(xì)胞。

三、吉西他濱對(duì)PANC1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(resistance index, RI)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，以含0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液處理PANC1細(xì)胞，以含50、100、150、200、300 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液處理PANC1-GR細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以未處理細(xì)胞作為對(duì)照。48 h后更換培養(yǎng)液，每孔加入10 μl的CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)3 h，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度值(A450值)。繪制生長(zhǎng)曲線獲取IC50值，通過(guò)公式計(jì)算RI。RI=PANC1-GR的IC50值/PANC1的IC50值。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PANC1細(xì)胞HMGB1、Beclin1蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1、PANC1-GR及siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分別用150 μmol/L吉西他濱誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，通過(guò)RIPA裂解液獲取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA試劑盒定量后，取30 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HMGB1及自噬標(biāo)志蛋白Beclin1的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。小鼠抗人HMGB1、Beclin1單抗均1∶1 000稀釋，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶2 000稀釋，最后經(jīng)ECL發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)(ImageQuant, GE)成像，應(yīng)用Image J圖像分析軟件檢測(cè)各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

五、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

取上述4株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用150 μmol/L吉西他濱處理48 h。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500 μl的Binding buffer懸浮細(xì)胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，混勻后置室溫避光反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、吉西他濱對(duì)4株P(guān)ANC1細(xì)胞的IC50值

PANC1細(xì)胞在100 μmol/L吉西他濱處理后能穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代，從而建立了PANC1-GR細(xì)胞株。吉西他濱對(duì)PANC1和PANC1-GR的IC50值分別為(4.7±0.4)μmol/L和(166.5±13.6)μmol/L，PANC1-GR細(xì)胞顯著高于PANC1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-25.826，P<0.01)；RI均值為35.4。siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細(xì)胞的IC50值分別為(3.2±0.3)、(52.4±8.4)μmol/L，顯著低于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為8.257、14.524，P值均<0.01)；RI均值為16.4。

二、PANC1和PANC1-GR細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)

PANC1和PANC1-GR細(xì)胞HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.08和0.38±0.11，PANC1-GR細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于PANC1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.934，P<0.01，圖1)。

三、4株P(guān)ANC1細(xì)胞的Beclin1蛋白表達(dá)

PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR細(xì)胞Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.68±0.33、3.28±0.15、0.68±0.23、0.78±0.11，2株轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Beclin1表達(dá)量顯著低于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.853、14.62，P值均<0.01，圖2)。

圖1 HMGB1蛋白在PANC1(1)、PANC1-GR(2)細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 Beclin1蛋白在PANC1(1)、siRNA-HMGB1-PANC1(2)、PANC1-GR(3)、siRNA-HMGB1-PANC1-GR(4)細(xì)胞中的表達(dá)

四、4株P(guān)ANC1細(xì)胞的凋亡率

PANC1、PANC1-GR、siRNA-HMGB1-PANC1、siRNA-HMGB1-PANC1-GR的細(xì)胞凋亡率分別為(34.58±3.14)%、(19.41±1.53)%、(79.56±3.58)%、(34.57±2.94)%，2株轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率均顯著高于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-49.717、-24.753，P值均<0.01，圖3)。

討 論

細(xì)胞自噬是細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下，通過(guò)清除胞質(zhì)內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、脂類及受損細(xì)胞器，回收代謝物質(zhì)、降低活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)傷害的一種自救和質(zhì)控方式[5-6]。目前研究證實(shí)，放化療過(guò)程中一部分癌細(xì)胞能夠通過(guò)自噬的方式獲得耐藥性，從而逃避凋亡命運(yùn)[7]。

胰腺癌細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出的組成性自噬被抑制時(shí)，ROS增加，引起DNA損傷和線粒體氧化磷酸化減少，進(jìn)而使胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制導(dǎo)致腫瘤消退[8-9]。而ROS過(guò)度會(huì)引起HMGB1的易位和釋放，二硫化物HMGB1與RAGE結(jié)合，誘導(dǎo)Beclin 1依賴性自噬，并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物或電離輻射的抗性[10-11]。HMGB1-RAGE途徑在誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用， 抑制HMGB1-RAGE可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞凋亡增加和自噬減少，而RAGE可通過(guò)p53抑制化療引起的細(xì)胞凋亡。核內(nèi)p53以轉(zhuǎn)錄依賴的方式刺激自噬，而胞質(zhì)內(nèi)p53以不依賴轉(zhuǎn)錄的方式抑制自噬體的形成[12-13]。RAGE還可通過(guò)降低雷帕霉素靶標(biāo)(mTOR)的磷酸化或增加Beclin 1-Vps34相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)介導(dǎo)自噬體形成的某些分子，維持自噬水平[14]。因此，HMGB1的自噬調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)HMGB1-RAGE途徑介導(dǎo)的，內(nèi)源性HMGB1是增強(qiáng)細(xì)胞存活并限制程序性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[15]。

圖3 PANC1(3A)、siRNA-HMGB1-PANC1(3B)、PANC1-GR(3C)、siRNA-HMGB1-PANC1-GR(3D)的細(xì)胞凋亡

本研究結(jié)果顯示，抑制HMGB1表達(dá)可下調(diào)自噬標(biāo)志蛋白Beclin1，從而改善PANC1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。以HMGB1為靶標(biāo)，利用HMGB1受體的單抗和轉(zhuǎn)染抑制劑，抑制HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并與其他抗癌藥物協(xié)同作用可能是克服腫瘤細(xì)胞抗藥性的有效策略。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Baines AT, Martin PM, Rorie CJ. Current and emerging targeting strategies for treatment of pancreatic cancer[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2016,144:277-320.DOI:10.1016/bs.pmbts.2016.09.006.

[2] Fogel EL, Shahda S, Sandrasegaran K, et al. A multidisciplinary approach to pancreas cancer in 2016: A review[J].Am J Gastroenterol,2017,112(4):537-554.DOI:10.1038/ajg.2016.610.

[3] Kang R, Tang D, Lotze MT, et al. RAGE regulates autophagy and apoptosis following oxidative injury[J].Autophagy,2011,7(4):442-444.

[4] Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, et al. HMGB1 and RAGE in inflammation and cancer[J].Annu Rev Immunol,2010,28:367-388.DOI: 10.1146/annurev.immunol.021908.132603.

[5] Auberger P, Puissant A. Autophagy, a key mechanism of oncogenesis and resistance in leukemia[J].Blood,2017,129(5):547-552.DOI:10.1182/blood-2016-07-692707.

[6] Gugnoni M, Sancisi V, Manzotti G, et al. Autophagy and epithelial-mesenchymal transition: an intricate interplay in cancer[J].Cell Death Dis,2016,7(12):e2520.DOI:10.1038/cddis.2016.415.

[7] Yang ZJ, Chee CE, Huang S, et al. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications[J].Mol Cancer Ther,2011,10(9):1533-1541.DOI:10.1158/1535-7163.MCT-11-0047.

[8] Kang R, Tang D. Autophagy in pancreatic cancer pathogenesis and treatment[J].Am J Cancer Res,2012,2(4):383-396.

[9] Yang S, Wang X, Contino G, et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth[J].Genes Dev,2011,25(7):717-729.DOI: 10.1101/gad.2016111.

[10] Tang D, Loze MT, Zeh HJ, et al. The redox protein HMGB1 regulates cell death and survival in cancer treatment[J].Autophagy,2010,6(8):1181-1183.DOI:10.4161/auto.6.8.13367.

[11] Mou K, Liu W, Han D, et al. HMGB1/RAGE axis promotes autophagy and protects keratinocytes from ultraviolet radiation-induced cell death[J].J Dermatol Sci,2017,85(3):162-169.DOI: 10.1016/j.jdermsci.2016.12.011.

[12] Kang R, Tang D, Loze MT, et al. Apoptosis to autophagy switch triggered by the MHC class III-encoded receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)[J].Autophagy,2011,7(1):91-93.DOI: 10.1038/cdd.2009.149.

[13] Livesey KM, Kang R, Vernon P, et al. p53/HMGB1 complexes regulate autophagy and apoptosis[J].Cancer Res,2012,72(8):1996-2005.DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-2291.

[14] Kang R, Tang D, Schapiro NE, et al. The receptor for advanced glycation end products (RAGE) sustains autophagy and limits apoptosis, promoting pancreatic tumor cell survival[J].Cell Death Differ,2010,17(4):666-676.DOI: 10.1038/cdd.2009.149.

[15] Tang D, Kang R, Livesey KM, et al. Endogenous HMGB1 regulates autophagy[J].J Cell Biol,2010,190(5):881-892.DOI:10.1083/jcb.200911078.