王春宇，姜 民，侯冠宇，侯吉光*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春130021；3.延邊大學(xué)，吉林 延吉133000)

氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除失衡、抗氧化能力降低、自由基產(chǎn)生增多一種狀態(tài)，過度的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)表達(dá)異常、組織損傷，是衰老和很多疾病的主要誘因[1]。衰老自由基學(xué)說認(rèn)為機(jī)體自由基累積引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷是皮膚衰老中發(fā)揮重要作用，活性氧誘導(dǎo)胞內(nèi)p53等衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，是人類美容的主要挑戰(zhàn)之一[2]。

小柴胡湯是我國傳統(tǒng)中藥，在整個(gè)東亞已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史，長期以來一直作為抗感染藥物應(yīng)用。近些年來，對(duì)小柴胡湯的研究不斷深入，其抗炎[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗癌[5]、抑制變態(tài)反應(yīng)[6]等藥理作用已見報(bào)道。其抗氧化損傷和延緩皮膚衰老的作用也引起研究人員的關(guān)注，但其詳細(xì)機(jī)制并未見報(bào)道。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮的主要組成成分，在皮膚老化中擔(dān)當(dāng)重要角色[7]。本研究采用過氧化氫(H2O2)作為氧化劑誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(Humandermal fibroblast cell，HDF)損傷，觀察小柴胡湯水煎液對(duì)氧化損傷的HDF的保護(hù)作用，探究其保護(hù)機(jī)制，為小柴胡湯防止皮膚老化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

人皮膚成纖維細(xì)胞株(HDF)購自中科院上海細(xì)胞庫，由本室保藏。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑

柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗由吉大二院門診部門提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北京索萊寶生物科技公司；脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物科技公司；細(xì)胞內(nèi)活性氧reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Bcl-2、Bax、NF-kB、p53一抗購自美國Abcam公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗購自美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；倒置顯微鏡(Olympus ，日本)；ACCULAB電子天平(Sartorius，德國)；MTX-150型低溫高速離心機(jī)(Sartorius，德國)；全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(KCjunior，美國)；Mini-PROTEAN 3 垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

凍存的HDF細(xì)胞自液氮罐中取出,于37℃水浴鍋中快速復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，氣體環(huán)境為37℃、5% CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱。毎天均使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)等指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%以上，用胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。

1.5 HDF細(xì)胞H2O2損傷模型的建立和小柴胡湯水煎液保護(hù)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的HDF細(xì)胞，每皿3×105個(gè)接種于6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)皿中，或每孔6×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5% CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。隨后更換為含不同濃度(0、5、50、100、200、500 μmol/L)H2O2的DMEM培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)4 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，通過細(xì)胞活力分析選擇合適的H2O2濃度。

小柴胡湯配伍后加10倍量水浸泡10 h，煎煮2 h后過濾，再加10倍量水煎煮2 h，合并兩次濾液，濃縮至50 mg/ml備用。小柴胡湯水煎液保護(hù)實(shí)驗(yàn)中HDF細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h，隨后在含不同濃度(20、50、100 μg/mL)小柴胡湯水煎液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，最后更換為含H2O2的DMEM培養(yǎng)基溶液培養(yǎng)4 h。同時(shí)設(shè)置H2O2模型組(不加藥物)；空白對(duì)照組(不加藥物和H2O2)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞活力的測定

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的HDF細(xì)胞每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后棄去培養(yǎng)基，加入200 μl DMSO，震蕩15 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸收值。

1.7 MDA、SOD及ROS的測定

胰蛋白酶消化收集6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HDF細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒上說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定MDA、 SOD及ROS含量。

1.8 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

胰蛋白酶消化收集6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HDF細(xì)胞，加入100 μl冰預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上孵育60 min，孵育期間每隔10 min超聲一次，使得蛋白得以充分裂解，低溫高速離心機(jī)4℃ ,15 000 r×30 min離心收集上清液，于-70℃中保存。使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白，上樣量為20 μg。將分離后蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，室溫條件下的封閉液中孵育30 min，隨后與一抗室溫孵育60 min，洗膜后與二抗孵育60 min。使用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測標(biāo)記結(jié)合信號(hào)，用 Gel-Pro 凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描電泳條帶， QuantityOne軟件分析各條帶光密度值，系統(tǒng)自動(dòng)生成結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HDF細(xì)胞的H2O2氧化損傷模型的建立

如表1所示：H2O2濃度小于50 μmol/L時(shí)對(duì)HDF細(xì)胞存活影響較小，50 μmol/LH2O2組細(xì)胞存活率達(dá)87.9%；隨著H2O2濃度增高，細(xì)胞存活率逐漸降低。其中200 μmol/LH2O2組細(xì)胞存活率為25.3%；當(dāng)濃度增加至500 μmol/LH2O2時(shí)大部分細(xì)胞死亡。因此選擇200 μmol/LH2O2作為模型的損傷濃度。

表1 不同濃度H2O2對(duì)HDF細(xì)胞活力的影響

注：與0 μmol/L H2O2組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.2 小柴胡湯水煎液對(duì)HDF細(xì)胞增殖能力的影響

如表2所示：小柴胡湯水煎液保護(hù)組相對(duì)于H2O2模型組細(xì)胞存活率均明顯提高，且隨著小柴胡湯水煎液濃度的提高，細(xì)胞存活率逐漸提高，其中100 μg/mL保護(hù)組細(xì)胞存活率高達(dá)84.1%，相對(duì)于H2O2模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明小柴胡湯水煎液保護(hù)能明顯降低H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

表2 不同濃度小柴胡湯水煎液對(duì)HDF細(xì)胞活力的影響

注：與空白對(duì)照組相比，##表示P<0.05；與H2O2模型組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.3 小柴胡湯水煎液對(duì)HDF細(xì)胞MDA 、SOD及ROS含量的影響

如表3所示：與空白對(duì)照組相比，H2O2模型組SOD含量顯著降低(P<0.01)，而MDA含量和ROS熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)。當(dāng)添加不同濃度的小柴胡湯水煎液保護(hù)后，HDF細(xì)胞MDA、SOD及ROS含量均有回復(fù)；其中100 μg/mL保護(hù)組相對(duì)于H2O2模型組SOD含量顯著升高(P<0.01)，MDA含量和ROS熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，表明小柴胡湯水煎液保護(hù)能顯著降低胞內(nèi)過氧化程度。

表3 不同濃度小柴胡湯水煎液對(duì)HDF細(xì)胞MDA、SOD及ROS含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比，##表示P<0.05；與H2O2模型組相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.4 小柴胡湯水煎液HDF細(xì)胞NF-kB、p53、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量的影響

如圖1所示：與空白對(duì)照組相比，H2O2模型組NF-kB、p53、Bax表達(dá)均顯著提高(P<0.05)，而Bcl-2表達(dá)卻顯著降低(P<0.01)。而100 μg/mL小柴胡湯水煎液保護(hù)組相對(duì)于H2O2模型組NF-kB、p53、Bax表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，而Bcl-2表達(dá)卻顯著升高(P<0.01)。

3 討論

小柴胡湯是我國著名的和解少陽劑，功可疏利三焦、調(diào)達(dá)上下、宣通內(nèi)外、和暢氣機(jī)、扶正祛邪、調(diào)整臟腑功能，可疏肝、調(diào)脾、和胃、氣血兼治。近些年來，對(duì)小柴胡湯的研究不斷深入，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展。陳軍[7]等評(píng)價(jià)了小柴胡湯體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)小柴胡湯對(duì)O2-、·OH、DPPH三種自由基的清除作用有明顯的量效相關(guān)性，可能在抗皮膚衰老中發(fā)揮重要作用。日本學(xué)者在小鼠慢性胰腺炎模型中發(fā)現(xiàn)小柴胡湯在胰腺組織中具有明顯的抗炎癥、抗纖維化、抗氧化、抗凋亡作用[8]，并在隨后的體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證小柴胡湯降低胞內(nèi)自由基含量，上調(diào)p53等衰老相關(guān)蛋白表達(dá)[9]。

注：1為空白對(duì)照組，2為H2O2模型組，3為100 μg/mL 小柴胡湯水煎液保護(hù)組

圖1不同濃度小柴胡湯水煎液對(duì)HDF細(xì)胞Bcl-2、Bax、NF-kB、p53表達(dá)的影響

過度的氧化應(yīng)激會(huì)破壞DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物膜和細(xì)胞核的損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡，是衰老的主要成因之一。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮的主要組成成分，富含膠原蛋白，Bayreuther表型實(shí)驗(yàn)表明成纖維細(xì)胞的凋亡和生長抑制是皮膚老化的原因之一[10]。本研究采用H2O2誘導(dǎo)HDF細(xì)胞內(nèi)自由基堆積，制備細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，發(fā)現(xiàn)H2O2濃度與細(xì)胞存活率呈反比，表明H2O2濃度與細(xì)胞損傷程度相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]一致，并選擇200μmol/LH2O2作為模型的損傷濃度。而小柴胡湯水煎液的干預(yù)能明顯提高受H2O2氧化應(yīng)激損傷的HDF細(xì)胞的存活率，提示小柴胡湯對(duì)誘導(dǎo)的H2O2細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

H2O2進(jìn)入HDF細(xì)胞后，會(huì)通過多種代謝途徑在胞內(nèi)產(chǎn)生氧自由基，本研究中H2O2損傷導(dǎo)致胞內(nèi)ROS含量升高，而小柴胡湯水煎液的干預(yù)降低了胞內(nèi)ROS含量。MDA是自由基攻擊生物膜不飽和脂的主要產(chǎn)物，反映氧自由基對(duì)生物膜的損傷大小，SOD是重要的氧自由基清除酶，反映機(jī)體對(duì)自由基的清除能力，兩者是氧自由基代謝的主要指標(biāo)，間接反映了細(xì)胞過氧化程度。本研究中H2O2損傷導(dǎo)致胞內(nèi)SOD活性降低，MDA生成增加，表明H2O2引發(fā)HDF細(xì)胞過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷；小柴胡湯水煎液的干預(yù)能明顯提高胞內(nèi)SOD活性，降低MDA生成，其中100 μg/mL保護(hù)組與空白對(duì)照組指標(biāo)最接近，提示小柴胡湯對(duì)H2O2造成的HDF細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。

ROS能激活NF-kB表達(dá)，在H2O2氧化損傷的HDF細(xì)胞中NF-kB表達(dá)增加，并激活典型的衰老蛋白p53的表達(dá)[12]。Bcl-2和Bax是p53的下游靶基因，Wood[13]等報(bào)道Bcl-2能通過抑制氧化反應(yīng)通路增強(qiáng)小鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3的抗氧化能力，而Bcl-2/Bax比率的提高能夠抑制H2O2引起的NIH-3T3細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2氧化損傷的HDF細(xì)胞中NF-kB表達(dá)上調(diào)，柴胡湯水煎液的干預(yù)能降低NF-kB的表達(dá)，引發(fā)衰老蛋白p53表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而升高Bcl-2/ Bax比率，對(duì)HDF細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用。

皮膚衰老是人類美容的天敵，降低表皮細(xì)胞氧自由基生成，減少其氧化損傷是延緩皮膚衰老的有效方法之一。本研究表明小柴胡湯對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人類成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)作用，小柴胡湯的主要藥理作用是降低胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，提高細(xì)胞抗氧化能力，其機(jī)制在于降低NF-kB表達(dá)，導(dǎo)致p53表達(dá)下調(diào)與Bcl-2/ Bax比率升高。

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