張 林， 王永紅， 韓兆玉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京 210095； 2.駐馬店華中正大有限公司，河南駐馬店 463000)

金霉素(chlortetracycline，簡稱CTC)屬于四環(huán)素類廣譜抗生素，對葡萄球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽性球菌非常有效，在動物疾病防治方面發(fā)揮了重要作用。此外，CTC還具有促進(jìn)動物體生長的特點(diǎn)，因此低劑量的飼料級金霉素被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料添加劑。研究表明，飼料中持續(xù)添加低劑量金霉素對肉雞具有顯著的促生長作用[1]，在肉仔雞日糧中添加150 mg/kg CTC，能夠顯著地提高肉仔雞的增質(zhì)量速率和飼料轉(zhuǎn)化效率，改善率分別為6.43%、5.66%[2]。在斷奶仔豬日糧中添加一定量的金霉素可顯著提高仔豬采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，增加日增質(zhì)量，降低腹瀉率[3-4]，而在育肥期促進(jìn)作用不明顯[5]。目前，國內(nèi)關(guān)于金霉素在雞、豬飼養(yǎng)上的研究比較常見，而在牛、羊等反芻動物上的研究則鮮有報道。國外有研究表明，金霉素可通過改變機(jī)體的內(nèi)分泌軸[6]，進(jìn)而影響動物生長。當(dāng)肉牛的低蛋白日糧中添加350 mg/d CTC，可有效提高血漿中IGF-1的含量[7]。金霉素作為一種促生長添加劑大量應(yīng)用在養(yǎng)殖中，長期使用必將影響畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本試驗將探索不同金霉素含量的日糧對肉牛生長性能和免疫性能的影響，為合理高效使用金霉素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗分組與飼養(yǎng)管理

試驗于2016年5月在江蘇億森牧業(yè)有限公司進(jìn)行，選擇年齡、膘情、體質(zhì)量(147.94±4.59) kg相近，未使用過抗菌藥的西門塔爾牛犢30頭，隨機(jī)分為對照組、試驗Ⅰ和試驗Ⅱ組，每組10頭牛，供試30頭公牛全部舍飼拴養(yǎng)，對照組：精料中不添加任何抗生素；試驗Ⅰ組：每1 000 kg精料中添加 1.33 kg 喜特肥(200 mg/kg CTC)；試驗Ⅱ組：每1 000 kg精料中添加2.67 kg喜特肥(400 mg/kg CTC)。試驗開始前7 d為預(yù)飼期，預(yù)飼期結(jié)束后正式開始試驗，試驗期為60 d。試驗期每天06：00和17：00飼喂日糧，飼喂模式為精料+粗飼料，每天飼喂1.6 kg精料和3.5 kg花生秸，自由飲水，基礎(chǔ)精料組成及營養(yǎng)水平見表1。本試驗所使用金霉素的商品名為喜特肥(Citifac)，純度為15%，由駐馬店華中正大有限公司提供。

表1 精料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

注：①1 kg預(yù)混料有效營養(yǎng)包括維生素A 3 100 IU、維生素D 850 IU、維生素E 30 IU、鐵50.00 mg、銅10.00 mg、鋅35.00 mg、錳60.00 mg、碘0.30 mg、鈷0.12 mg、硒0.16 mg。②基礎(chǔ)精料營養(yǎng)水平為計算值。

1.2 樣本采集與測定

1.2.1 生長性能指標(biāo)測定 試驗開始前和結(jié)束后，每頭肉牛于晨飼前分別空腹稱體質(zhì)量1次，計算平均日增質(zhì)量(ADG)；分別測量每頭牛的體高、腰高、體長、胸圍和胸深，并計算育肥指數(shù)、體長指數(shù)和胸圍指數(shù)。育肥指數(shù)=體質(zhì)量/體高×100%，體長指數(shù)=體斜長/體高×100%，胸圍指數(shù)=胸圍/體高×100%。試驗期間，每天記錄每頭肉牛的采食量，計算料重比(F/G)。ADG=(末質(zhì)量-初質(zhì)量)/天數(shù)；F/G=平均日采食量/平均日增質(zhì)量。

1.2.2 血液生化指標(biāo)測定 試驗開始前和結(jié)束后，肉牛于晨飼前由頸靜脈采血10 mL，靜置1～2 h后3 500 r/min離心 20 min，收集血清于-20 ℃保存，待測。

測定指標(biāo)包括血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量(生化法)；免疫球蛋白(IgG)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4(免疫比濁法)、溶菌酶活性(比濁法)；血清超氧化物歧化酶活性(orgotein superoxide dismutase，SOD，WST-1法)；丙二醛含量(MDA，TBA法)、谷胱甘肽過氧化物酶活性(GSH-Px，比色法)，試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.2.3 糞便中金霉素殘留及大腸桿菌耐藥性檢測 試驗結(jié)束后，對每頭肉牛分別進(jìn)行直腸糞樣采集，將收集到的糞樣放到滅菌塑料管中置于冰上帶回實驗室，用于后續(xù)試驗研究。用于糞便中金霉素殘留檢測的糞樣置于-80 ℃冷凍保存，并采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法對糞便中金霉素含量進(jìn)行檢測。用于大腸桿菌耐藥性檢測的新鮮糞樣，迅速劃麥康凱培養(yǎng)基，擴(kuò)增大腸桿菌單菌落做金霉素MIC試驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。試驗各組之間的差異分析采用單因子方差(one-way ANOVA)分析，多重比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)。結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素對肉牛體尺、體重的影響

由表2可知，在試驗前，對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的各項體尺指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。試驗后60 d，試驗Ⅰ組的體高、腰高、體長和胸深均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；胸圍、育肥指數(shù)、體長指數(shù)和胸圍指數(shù)均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅱ組的體高、胸圍、胸深和胸圍指數(shù)均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；腰高、體長、育肥指數(shù)和體長指數(shù)均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。此外，試驗后60 d試驗Ⅱ組的體長顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)。由表3可知，與對照組相比，試驗后60 d時試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的體質(zhì)量分別增加7.67、6.50 kg，總增質(zhì)量分別提高7.46、6.92 kg，平均日增質(zhì)量分別提高118.33、111.67 g，料質(zhì)量比分別降低1.82、1.19，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 金霉素對肉牛體尺的影響

注：同列數(shù)據(jù)后相同時間點(diǎn)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無字母表示差異不顯著。下表同。

表3 金霉素對試驗后60 d肉牛體質(zhì)量的影響

2.2 金霉素對肉牛血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，在試驗前，對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的血清總蛋白、白蛋白、球蛋白含量均無顯著差異(P>0.05)。試驗后60 d時，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量均低于對照組，其中試驗Ⅰ組的血清總蛋白、白蛋白和球蛋白含量顯著降低(P<0.05)。由表5可知，在試驗前，對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的溶菌酶和補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、IgG、GSH-Px、MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。試驗后60 d，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的溶菌酶活性和補(bǔ)體C4、IgG、GSH-Px含量均高于對照組，其中試驗Ⅱ組的溶菌酶活性和補(bǔ)體C4、GSH-Px含量顯著高于對照組(P<0.05)；試驗Ⅱ組的SOD活性顯著高于試驗Ⅰ組和對照組(P<0.05)；試驗Ⅰ組的MDA含量顯著高于對照組和試驗Ⅱ組(P<0.05)。

2.3 糞便中金霉素的殘留及對大腸桿菌耐藥性的影響

由表6可知，試驗后60 d，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組中金霉素殘留量分別為452.58、648.20 μg/kg，遠(yuǎn)低于添加量。試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組中金霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)均從6 μg/mL 提高到了32 μg/mL，耐藥性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

表4 金霉素對肉牛血清蛋白的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 金霉素對肉牛生長性能的影響

目前，有關(guān)金霉素促生長的機(jī)制并不清晰，有研究認(rèn)為這可能與抗生素能夠改善動物消化道微生物和腸道壁厚度有關(guān)[8]。Reeks等研究發(fā)現(xiàn)，CTC能夠有效抑制巴斯德桿菌、曼氏桿菌、嗜血桿菌的有害細(xì)菌，利于動物生長[9]。Rumsey等研究表明，日糧中添加350 mg/d CTC會增加肉牛脂肪沉淀，提高能量利用率，但增質(zhì)量效果不明顯[10]。Reid等也發(fā)現(xiàn)，金霉素對12月齡奶牛的日增質(zhì)量、飼料轉(zhuǎn)化率以及體長無影響[11]。本試驗結(jié)果表明，日糧中添加金霉素能夠一定程度地提高肉牛的日增質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率，但效果不顯著。這可能與飼喂時間有關(guān)，馬玉龍等研究發(fā)現(xiàn)，金霉素的促生長效果隨日齡的增加而減弱，對肉雞飼料轉(zhuǎn)化效率的影響也因日齡不同而有所不同[12]。

表5 金霉素對肉牛血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響

表6 糞便中金霉素的殘留及對大腸桿菌耐藥性的影響

3.2 金霉素對肉牛血清蛋白的影響

血液生化指標(biāo)是機(jī)體正常生理功能和代謝過程的內(nèi)在反映。血清蛋白主要由肝臟合成，當(dāng)肝臟發(fā)生病變時會導(dǎo)致蛋白合成能力減弱[13]，血清蛋白含量的變化往往伴隨著體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變和疾病的發(fā)生[14]，本試驗中添加金霉素組的血清總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量均低于對照組，這可能是由于金霉素增加了肝臟的負(fù)擔(dān)，使肝臟合成蛋白的能力進(jìn)一步減弱。

3.3 金霉素對肉牛免疫功能的影響

溶菌酶是單核細(xì)胞分泌的非特異性免疫因子，具有活化吞噬細(xì)胞、呈遞抗原、溶菌、增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力的作用，是機(jī)體重要的非特異性免疫物質(zhì)[15]。補(bǔ)體是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，經(jīng)活化后可協(xié)助特異性抗體吞噬病菌，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。在補(bǔ)體系統(tǒng)中C3含量最多，是主要激活途徑中的中心環(huán)節(jié)；C4能夠協(xié)助免疫球蛋白清除病原微生物[16-17]。IgG是動物血清中主要的抗體成分，約占血清免疫球蛋白的75%，能夠特異性結(jié)合抗原，具有抗菌、抗病毒等功能，是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[18]。本試驗結(jié)果顯示，添加金霉素組的溶菌酶活性和補(bǔ)體C4、IgG含量均高于對照組，表明飼料中添加400 mg/kg CTC有提高肉牛免疫力的趨勢，尤其是非特異性免疫功能。

3.4 金霉素對肉?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

正常生理狀態(tài)下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡[19]，平衡一旦被打破，自由基的濃度升高將會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生丙二醛(MDA)，造成細(xì)胞損傷。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能及時修復(fù)因自由基造成的損傷，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶，能還原有毒的過氧化物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。在本試驗中各組的SOD、GSH-Px活性均降低，MDA的含量增加，說明機(jī)體均發(fā)生了有害的過氧化反應(yīng)。試驗Ⅰ組的MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，而其SOD和GSH-Px活性與對照組差異不顯著；試驗Ⅱ組的MDA含量低于對照組，但差異不顯著。添加400 mg/kg金霉素組的SOD和GSH-Px活性均顯著高于對照組，且MDA含量低于對照組，說明機(jī)體在受到過氧化損傷時，能夠更好地減弱不利損害。

3.5 糞便中金霉素的殘留及對大腸桿菌耐藥性的影響

金霉素作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用在豬和肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中，甚至超過規(guī)定劑量。研究表明，抗生素進(jìn)入動物體內(nèi)并不能被完全吸收，25%～75%將會隨糞便和尿液排出體外[20]，并保持生物活性。長期使用金霉素飼料添加劑不僅有增加腸道微生物耐藥性的危險，還可能會造成水體和土壤產(chǎn)生大量耐藥菌，危害環(huán)境[21]。本試驗結(jié)果顯示，糞便中檢測到的金霉素含量分別只有452.58、648.20 μg/kg，不足添加量的1%，本試驗發(fā)現(xiàn)200、400 mg/kg CTC 對大腸桿菌最小抑菌濃度均從6 μg/mL提高到了32 μg/mL，顯著提高了大腸桿菌的耐藥性。

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