王彥秋

0 引言

宮頸癌(Cervical cancer)是發(fā)生于女性生殖器的一種惡性腫瘤，其中85%的宮頸癌患者分布在發(fā)展中國家，嚴重威脅女性生命安全[1]。目前，治療宮頸癌的主要方法是手術(shù)清除輔以放化療治療，順鉑(Cisplatin，DDP)是常用的化療藥物之一[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，某些宮頸癌患者易對順鉑產(chǎn)生耐藥性[3]。冬凌草甲素(Oridonin，ORI)因其具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎癥等藥理活性[4]，已作為一種抗腫瘤中藥應(yīng)用于乳腺癌[5]、肺癌[6]等惡性腫瘤的治療。目前，尚未見關(guān)于聯(lián)合采用冬凌草甲素、順鉑治療宮頸癌的相關(guān)研究。因此,本研究通過觀察冬凌草甲素、順鉑聯(lián)合用藥對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響，探討其機制，試圖為臨床治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人宮頸癌SiHa細胞，購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 冬凌草甲素(純度>98%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；順鉑注射液，購自江蘇豪森藥業(yè)公司，批準文號：H20040813；DMSO、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素，購自美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒、MTT試劑盒，購自碧云天公司；96孔板(Bio-Rad)；反轉(zhuǎn)試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，購自日本Takara公司；蛋白裂解buffer；BCA試劑盒，購自美國Thermo公司；抗體，購自美國CST公司。CO2培養(yǎng)箱；日本Sanyo公司；Elx800酶標儀，購自Bio-Rad公司；Thermal Cycler Dice Real Time System，購自日本Takara公司；熒光顯微鏡，購自美國Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌SiHa細胞系，加入DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)進行培養(yǎng)，加入鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 U/mL)防止細菌污染，于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2，37 ℃)進行培養(yǎng)，所有操作在無菌條件進行，收集進入對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT實驗檢測SiHa細胞增殖情況 采用MTT實驗對冬凌草甲素和順鉑單獨作用SiHa細胞增殖情況進行檢測。將對數(shù)期SiHa細胞(1.0×105個/孔)接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入冬凌草甲素(4、8、16、32、64 μg/mL)、順鉑(1、2、4、8、16 μg/mL)處理SiHa細胞，同時設(shè)置冬凌草甲素空白對照組(加入等量0.1% DMSO)和順鉑空白對照組(加入等量0.9%生理鹽水)。分別在作用12、24、36、48、60、72 h后，收集細胞，按照MTT試劑盒說明書進行操作，使用全自動酶標儀檢測570 nm波長下各孔細胞吸光值(OD)。計算不同藥物濃度對SiHa細胞的生長抑制率。細胞生長抑制率(%)=(1-藥物處理組吸光值/對照組吸光值)×100%。每個濃度設(shè)置4個重復，實驗重復3次。

1.2.3 MTT實驗檢測冬凌草甲素聯(lián)合順鉑作用SiHa細胞增殖情況 根據(jù)“1.2.2”項所得細胞生長抑制率曲線，結(jié)合臨床冬凌草甲素和順鉑的使用劑量，選擇冬凌草甲素的最適用藥濃度：32 μg/mL；順鉑的最適用藥濃度：4 μg/mL。將對數(shù)期SiHa細胞(3.0×105個/孔)接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后將SiHa細胞分為4組：對照組(0.1% DMSO)、冬凌草甲素組(32 μg/mL)、順鉑組(4 μg/mL)、冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組，分別加入相應(yīng)藥物，作用48 h后收集細胞，按照“1.2.2”項方法，計算不同藥物對SiHa細胞的生長抑制率。細胞增殖率(%)=藥物處理組吸光值/對照組吸光值×100%，每組設(shè)置4個重復，實驗重復3次。

1.2.4 流式AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測宮頸癌SiHa細胞凋亡情況 收集冬凌草甲素、順鉑單獨或聯(lián)合處理的SiHa細胞(參見“1.2.3”項)，嚴格按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書，逐步進行操作，利用流式細胞儀進行檢測，采用BD FACSDiva Software對試驗結(jié)果進行采集并分析。每組設(shè)置4個重復，實驗重復3次。

1.2.5 Hoechest33258染色法檢測細胞凋亡 收集冬凌草甲素、順鉑單獨或聯(lián)合處理的SiHa細胞(參見“1.2.3”項)，按照Hoechest33258熒光染色法說明進行操作，置于熒光顯微鏡下觀察SiHa細胞形態(tài)。在340 nm激光下，活細胞呈均勻彌散藍色熒光，凋亡細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.2.6 qRT-PCR檢測宮頸癌SiHa細胞FOXL2、Ki67 mRNA水平 收集冬凌草甲素、順鉑單獨用藥和聯(lián)合用藥處理的細胞(參見“1.2.3”項)，Trizol法提取總RNA，并檢測其濃度和質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。FOXL2、Ki67 mRNA表達水平按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)操作說明，在Takara熒光定量PCR儀上進行檢測。反應(yīng)體系總體積10 μL∶cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 6 μL，dH2O 2 μL。按反應(yīng)條件進行擴增：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40個循環(huán)。擴增標準曲線結(jié)果顯示，R2≥0.98，擴增效率0.95～1.1，表明引物擴增效率高且特異性符合標準。每個濃度做3個重復。采用2-ΔΔCT法，對qRT-PCR結(jié)果進行表達差異分析。FOXL2、Ki67及內(nèi)參基因GAPDH qRT-PCR引物，如表1所示。

表1 FOXL2、Ki67、GAPDH qRT-PCR引物

1.2.7 Western blot檢測宮頸癌SiHa細胞FOXL2、Ki67蛋白水平 收集冬凌草甲素、順鉑單獨用藥和聯(lián)合用藥處理的細胞(參見“1.2.3”項)，加入蛋白裂解buffer(含有protease inhibitor Cocktail)，提取各組細胞總蛋白。采用BCA蛋白試劑盒對細胞中總蛋白含量進行測定。以GAPDH蛋白表達水平作為內(nèi)參，采用Western blot對細胞中FOXL2、Ki67蛋白水平進行檢測。采用Tanon 6100圖像分析系統(tǒng)對Western結(jié)果拍照并進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素、順鉑單獨用藥對SiHa細胞增殖的影響 與對照組比較，16、32、64 μg/mL冬凌草甲素能顯著抑制SiHa細胞增殖，32 μg/mL冬凌草甲素作用SiHa細胞48 h，對細胞生長抑制率達52.7%±1.6%(見圖1A)。與對照組比較，4、8、16 μg/mL順鉑均能顯著抑制SiHa細胞增殖，8 μg/mL順鉑作用SiHa細胞，對細胞生長抑制率為50.9%±4.7%(見圖1B)。據(jù)此，本研究選擇冬凌草甲素32 μg/mL、順鉑4 μg/mL作用48 h，進行后續(xù)實驗。

2.2 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑抑制SiHa細胞增殖 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組細胞增殖率為27.33%±4.98%，顯著低于冬凌草甲素組55.00%±5.03%、順鉑組59.00%±5.77%、對照組102.30%±4.49%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；冬凌草甲素組、順鉑組細胞增殖率均明顯低于對照組(P<0.05)(見圖2)。根據(jù)活細胞數(shù)計算得出冬凌草甲素和順鉑CDI為0.01。

圖1 冬凌草甲素、順鉑單獨用藥對SiHa細胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；A.不同濃度冬凌草甲素對SiHa細胞增殖的影響，B.不同濃度順鉑對SiHa細胞增殖的影響

2.3 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑促進SiHa細胞凋亡 流式細胞儀檢測結(jié)果見圖3，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組細胞凋亡率為31.47%±2.24%，顯著高于冬凌草甲素組11.40%±1.01%、順鉑組19.30%±1.03%、對照組4.90%±0.87%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；冬凌草甲素組、順鉑組細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑用藥對SiHa細胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與冬凌草甲素組比較，#P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05

圖3 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑用藥對SiHa細胞凋亡的影響

注：A～D：流式AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測各組細胞凋亡情況(A.對照組，B.冬凌草甲素組，C.順鉑組，D.冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組)；E：冬凌草甲素、順鉑單獨或聯(lián)合用藥，SiHa細胞凋亡情況定量分析。與對照組比較，*P<0.05；與冬凌草甲素組比較，#P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05

Hoechest33258染色結(jié)果可見，與對照組比較，冬凌草甲素組、順鉑組及冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組部分細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)固縮，細胞核碎裂(見圖4)，其中聯(lián)合用藥組中呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)的細胞數(shù)目顯著多于單獨用藥組。

2.4 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑促進FOXL2 mRNA和蛋白表達 如圖5所示，與對照組比較，冬凌草甲素組、順鉑組、冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組FOXL2 mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與冬凌草甲素組比較，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組FOXL2 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與順鉑組比較，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組FOXL2 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

圖4 SiHa細胞Hoechest33258熒光染色結(jié)果

2.5 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑抑制Ki67 mRNA和蛋白水平 與對照組比較，冬凌草甲素、順鉑單獨及聯(lián)合用藥組Ki67 mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與冬凌草甲素組比較，聯(lián)合用藥組Ki67 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與順鉑組比較，聯(lián)合用藥組Ki67 mRNA和蛋白水平顯著下降(P<0.05)。見圖6。

圖5 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑用藥對SiHa細胞FOXL2 mRNA和蛋白水平的影響

圖6 冬凌草甲素聯(lián)合順鉑用藥對SiHa細胞Ki67 mRNA和蛋白水平的影響

3 討論

隨著國內(nèi)外對宮頸癌診治技術(shù)的不斷改進和完善、宮頸癌發(fā)病趨于年輕化，使得保留患者生育能力的要求和可能性逐漸提高。因化療在宮頸癌中取得的肯定療效，現(xiàn)已逐漸成為綜合治療宮頸癌的重要手段之一[8]。本研究以宮頸癌SiHa細胞為研究材料，觀察冬凌草甲素、順鉑聯(lián)合用藥對SiHa細胞凋亡的影響，并對冬凌草甲素聯(lián)合順鉑作用后細胞中FOXL2、Ki67 表達水平進行檢測，以揭示其作用機制，為冬凌草甲素、順鉑聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的臨床治療提供一定理論依據(jù)。

冬凌草甲素是分離自唇形科植物冬凌草的一種天然萜類化合物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多種藥理活性[9]。臨床應(yīng)用表明，冬凌草甲素對細胞的毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性。已有研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對腫瘤具有很強的預防和治療作用，能夠抑制肝癌細胞[9]、結(jié)腸癌細胞[10]及肺腺癌細胞[11]等多種腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡。Ma等[12]研究表明，冬凌草甲素能有效逆轉(zhuǎn)人卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性，誘導卵巢癌細胞凋亡。He等[13]研究表明，冬凌草甲素也能逆轉(zhuǎn)胃癌細胞對順鉑的耐藥性，誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組和單獨用藥組比較，冬凌草聯(lián)合順鉑作用宮頸癌SiHa細胞時，細胞增殖能力顯著降低，凋亡能力顯著升高。利用CDI對冬凌草甲素和順鉑相互作用的性質(zhì)進行評價，根據(jù)CDI=兩藥聯(lián)合組細胞吸光值/冬凌草甲素組細胞吸光值×順鉑組細胞吸光值，得到CDI為0.01[7]，表明冬凌草甲素和順鉑作用性質(zhì)為協(xié)同，且協(xié)同作用極顯著。

FOXL2是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子[14]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因突變或異常表達與一些發(fā)育性疾病及卵巢顆粒細胞瘤[15-16]、垂體瘤[17]等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因能夠抑制子宮內(nèi)膜異位癥的產(chǎn)生[18]。Liu等[19]研究表明，F(xiàn)OXL2基因在宮頸癌患者癌組織中異常高水平表達，且過表達FOXL2基因能夠抑制宮頸癌細胞Hela的增殖，促進其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑作用于宮頸癌SiHa細胞時，細胞中FOXL2基因mRNA和蛋白水平都明顯上調(diào)，顯著高于單獨用藥組和對照組。推測冬凌草甲素通過促進FOXL2基因上調(diào)表達，進一步加強順鉑對細胞增殖的抑制作用及其對細胞凋亡的促進作用，提示FOXL2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。

Ki67蛋白也稱MKI67，與細胞增殖密切相關(guān)，定位于細胞核，可作為細胞增殖的可靠標記物[20]。已有研究表明，Ki67與乳腺癌[21]、胃癌[22]、宮頸癌[23]的發(fā)生發(fā)展及預后有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，Ki67能作為結(jié)直腸癌[24]、乳腺癌[25]等惡性腫瘤的分子診斷標記。陳敏麗[26]研究發(fā)現(xiàn)，Ki67的表達在宮頸癌中顯著增高，與脈管浸潤及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組和單獨用藥組比較，冬凌草甲素聯(lián)合順鉑組Ki67 mRNA和蛋白水平均顯著下降。推測冬凌草甲素通過抑制Ki67表達，增強順鉑對細胞凋亡的促進作用。

綜上所述，冬凌草甲素能夠有效增強順鉑對宮頸癌SiHa細胞的促凋亡作用，推測其機制是通過上調(diào)抑癌基因FOXL2表達，下調(diào)Ki67表達，從而實現(xiàn)抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。這為冬凌草甲素、順鉑聯(lián)合應(yīng)用于治療宮頸癌的臨床推廣提供了新依據(jù)。

參考文獻：

[1] 周暉,盧淮武,彭永排,等.《2015年NCCN宮頸癌臨床實踐指南》解讀[J] .中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2015,31(3):185-191.

[2] Leekha A,Gurjar BS,Tyagi A,et al.Vitamin C in synergism with cisplatin induces cell death in cervical cancer cells through altered redox cycling and p53 upregulation[J] .J Cancer Res Clin Oncol,2016,142(12):2503-2514.

[3] Aggarwal U,Goyal AK,Rath G.Development and characterization of the cisplatin loaded nanofibers for the treatment of cervical cancer[J] .Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2017,75:125-132.

[4] 李舒荃,沈燦,楊亞洋,等.冬凌草甲素抑制人胰腺癌細胞IL-1家族細胞因子表達的研究[J] .科技通報,2017,33(4):47-51,60.

[5] 齊琦,張配,李其響,等.冬凌草甲素誘導三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及對細胞內(nèi)活性氧水平的影響[J] .中國中藥雜志,2017,42(12):2361-2365.

[6] 柳悄然,張在云,于曉明,等.冬凌草甲素對人肺癌NCI-H460細胞侵襲和遷移的影響[J] .中國病理生理雜志,2014,30(8):1497-1500.

[7] 湯秀紅,秦叔逵,陳惠英,等.三氧化二砷與順鉑合用抗人肝癌細胞株QGY-7701的實驗研究[J] .腫瘤防治研究,2002,29(5):362-364.

[8] 劉暢.苦參堿及聯(lián)合順鉑對宮頸癌SiHa細胞中TSLC1基因表達的影響[D] .蘭州大學,2014.

[9] 郭文治,王冬雨,李功權(quán),等.冬凌草甲素誘導肝癌細胞凋亡作用及其機制[J] .中華實驗外科雜志,2015,32(9):2157-2159.

[10] 邵換璋,許雋穎,丁軍利,等.冬凌草甲素抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的作用及其機制[J] .中華實驗外科雜志,2016,33(3):574-576.

[11] 王允,張玉媛,申玲.冬凌草甲素對肺腺癌A549細胞凋亡的影響及相關(guān)機制的研究[J] .毒理學雜志,2013,27(3):204-206.

[12] Ma S,Tan W,Du B,et al.Oridonin effectively reverses cisplatin drug resistance in human ovarian cancer cells via induction of cell apoptosis and inhibition of matrix metalloproteinase expression[J] .Mol Med Rep,2016,13(4):3342-3348.

[13] He Z,Xiao X,Li S,et al.Oridonin induces apoptosis and reverses drug resistance in cisplatin resistant human gastric cancer cells[J] .Oncol Lett,2017,14(2):2499-2504.

[14] Georges A,Auguste A,Bessière L,et al.FOXL2:a central transcription factor of the ovary[J] .J Mol Endocrinol,2014,52(1):R17-R33.

[15] Rosario R,Cohen PA,Shelling AN.The role of FOXL2 in the pathogenesis of adult ovarian granulosa cell tumours[J] .Gynecol Oncol,2014,133(2):382-387.

[16] Anttonen M,Pihlajoki M,Andersson N,et al.FOXL2,GATA4,and SMAD3 co-operatively modulate gene expression,cell viability and apoptosis in ovarian granulosa cell tumor cells[J] .PLoS One,2014,9(1):e85545.

[17] Chesnokova V,Zonis S,Wawrowsky K,et al.Clusterin and FOXL2 act concordantly to regulate pituitary gonadotroph adenoma growth[J] .Mol Endocrinol,2012,26(12):2092-2103.

[18] L′Hte D,Georges A,Todeschini AL,et al.Discovery of novel protein partners of the transcription factor FOXL2 provides insights into its physiopathological roles[J] .Hum Mol Genet,2012,21(14):3264-3274.

[19] Liu XL,Meng YH,Wang JL,et al.FOXL2 suppresses proliferation,invasion and promotes apoptosis of cervical cancer cells[J] .Int J Clin Exp Pathol,2014,7(4):1534-1543.

[20] Petrelli F,Viale G,Cabiddu M,et al.Prognostic value of different cut-off levels of Ki-67 in breast cancer:a systematic review and meta-analysis of 64,196 patients[J] .Breast Cancer Res Treat,2015,153(3):477-491.

[21] Elkablawy MA,Albasri AM,Mohammed RA,et al.Ki67 expression in breast cancer.Correlation with prognostic markers and clinicopathological parameters in Saudi patients[J] .Saudi Med J,2016,37(2):137-141.

[22] Li N,Deng W,Ma J,et al.Prognostic evaluation of Nanog,Oct4,Sox2,PCNA,Ki67 and E-cadherin expression in gastric cancer[J] .Med Oncol,2015,32(1):433.

[23] Kanthiya K,Khunnarong J,Tangjitgamol S,et al.Expression of the p16 and Ki67 in cervical squamous intraepithelial lesions and cancer[J] .Asian Pac J Cancer Prev,2016,17(7):3201-3206.

[24] Yang Y,Li J,Jin L,et al.Independent correlation between Ki67 index and circulating tumor cells in the diagnosis of colorectal cancer[J] .Anticancer Res,2017,37(8):4693-4700.

[25] Jalali C,Ghaderi B,Amini S,et al.Association of XRCC1 Trp194 allele with risk of breast cancer,and Ki67 protein status in breast tumor tissues[J] .Saudi Med J,2016,37(6):624-630.

[26] 陳敏利.VEGF和Ki67在宮頸鱗癌組織的表達及臨床意義[D] .延安大學,2016.