黃源，劉一為，項(xiàng)理，邢珺月，蘇展豪，張曉玲，孟健，王佩合，張浩

肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是以平均肺動(dòng)脈壓力和肺血管阻力不斷升高，肺血管重構(gòu)為特征的臨床綜合征，持續(xù)升高的肺血管壓力及阻力可導(dǎo)致右心后負(fù)荷增加，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡[1-5]。PAH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來有研究表明交感神經(jīng)系統(tǒng)（Sympathetic nervous system,SNS）在肺動(dòng)脈高壓患者中被激活[6-8]，同時(shí)神經(jīng)激素活化一定程度上促進(jìn)了肺動(dòng)脈高壓的病理生理改變[9]。與此同時(shí)，有動(dòng)物研究表明經(jīng)皮肺動(dòng)脈交感神經(jīng)消融術(shù)（Percutaneous pulmonary artery denervation，PADN）能消除球囊堵塞左肺動(dòng)脈遠(yuǎn)端導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓[10]，同時(shí)也有臨床研究表明通過PADN可以降低PAH患者的平均肺動(dòng)脈壓力及肺血管阻力，提高患者6分鐘步行距離[11,12]。本研究擬通過對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型行經(jīng)胸肺動(dòng)脈去神經(jīng)支配術(shù)，探討該手術(shù)是否可以降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓力，并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)及右心室肥厚。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：將24只雄性無特定病原體（Specefic pathogen free，SPF） 級(jí) Sprague Dawley（SD）大鼠，按1:1:1比例隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組及手術(shù)組。以上大鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重280～300 g。

方法：首先測量各組SD大鼠的平均肺動(dòng)脈壓等血流動(dòng)力學(xué)基線參數(shù)，之后對(duì)照組給予頸背部皮下一次性注射生理鹽水（60 mg/kg），假手術(shù)組和手術(shù)組給予頸背部皮下一次性注射野百合堿 （60 mg/kg）造模。注射野百合堿4周后，采用右心導(dǎo)管測量各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，造模成功后手術(shù)組遂行經(jīng)胸肺動(dòng)脈去神經(jīng)支配術(shù)，假手術(shù)組只開胸并不進(jìn)行肺動(dòng)脈去神經(jīng)支配術(shù)。手術(shù)2周后再采用右心導(dǎo)管測量各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。之后取心肺組織觀察其顯微形態(tài)學(xué)變化，并測量右心室肥厚指數(shù)（RVHI）。（1）SD大鼠平均肺動(dòng)脈壓的測量：常規(guī)麻醉大鼠，分離大鼠右側(cè)頸外靜脈，剪口后插入自制2F右心導(dǎo)管，導(dǎo)管通過壓力傳感器與生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞）相連，監(jiān)測壓力變化，在壓力波形的引導(dǎo)下，導(dǎo)管經(jīng)上腔靜脈進(jìn)入右心房、三尖瓣口、右心室，最后進(jìn)入肺動(dòng)脈干，測定平均肺動(dòng)脈壓力等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 （2）經(jīng)胸去肺動(dòng)脈交感神經(jīng)術(shù)過程：常規(guī)麻醉大鼠（腹腔注射戊巴比妥鈉 40 mg/kg），氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)（ALC-V8S型小動(dòng)物呼吸機(jī),奧爾科特生物科技公司），設(shè)定呼吸頻率30 次/min，潮氣量10 ml/kg。常規(guī)在大鼠左側(cè)2～3肋間小切口開胸，暴露肺動(dòng)脈后，剔除肺動(dòng)脈主干附近結(jié)締組織，之后關(guān)胸，常規(guī)術(shù)后護(hù)理。（3）右心室肥厚指數(shù)測定：處死三組SD大鼠后，剪除心房組織，沿室間隔邊緣分離出右心室（RV），左心室（LV）和室間隔（S），濾紙吸凈組織水分，以電子天平分布稱重RV和（LV+S）質(zhì)量，以公式RV/（LV+S）計(jì)算RVHI。 （4）心肺組織形態(tài)學(xué)檢查：分別取其肺組織、心臟組織，對(duì)肺組織分別進(jìn)行彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色（EVG染色）和肺動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白-內(nèi)皮細(xì)胞染色（SMA-VWF染色）。每只大鼠隨機(jī)選取5張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)直徑小于300 μm的肺小動(dòng)脈，用IPP3D（Image-Pro Plus 3D）圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算動(dòng)脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）。心臟組織分別進(jìn)行右心室心肌細(xì)胞膜染色（WGA染色）。每只大鼠隨機(jī)選取5張心臟組織橫斷面切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)右心室心肌細(xì)胞的橫切面視野，用IPP 3D進(jìn)行圖像分析，計(jì)算右心室心肌細(xì)胞的橫截面積。 （5）肺動(dòng)脈交感神經(jīng)的染色，將大鼠肺動(dòng)脈及周圍結(jié)締組織置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行酪氨酸羥化酶（abcam公司）染色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況（表1）

研究結(jié)果表明，手術(shù)組和假手術(shù)組在注射野百合堿第4周后，平均肺動(dòng)脈壓、右心室收縮壓，以及平均右心室壓和肺動(dòng)脈收縮壓均較注射前（基線水平）顯著升高 （P均＜0.01）；與對(duì)照組相比，手術(shù)組及假手術(shù)組這四項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均顯著升高（P均＜0.01），這表明肺動(dòng)脈高壓大鼠造模成功。此外，手術(shù)組在第6周，即術(shù)后2周時(shí)，其平均肺動(dòng)脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動(dòng)脈收縮壓較術(shù)前顯著降低（P＜0.01），而假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前相比持續(xù)升高（P＜0.01）；同時(shí)術(shù)后2周時(shí)，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組平均肺動(dòng)脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動(dòng)脈收縮壓明顯下降（P＜0.01）。

表1 三組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況（mmHg，±s）

表1 三組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化情況（mmHg，±s）

注：與基線水平相比*P＜0．01；與對(duì)照組相比△P＜0．01；與同組術(shù)前相比▲P＜0．01；與假手術(shù)組相比 #P＜0．01。1 mmHg=0．133 kPa

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=8) 假手術(shù)組(n=8) 手術(shù)組(n=8)平均肺動(dòng)脈壓基線水平 16．8±1．3 16．4±1．2 16．9±1．2第 4 周 (術(shù)前 ) 17．1±1．4 28．6±1．5*△ 29．0±1．9*△第 6周 (術(shù)后二周) 17．4±1．5 35．3±2．5▲ 21．5±1．6▲#右心室收縮壓基線水平 29．0±1．9 29．2±1．5 29．4±2．0第 4 周 (術(shù)前 ) 29．3±1．8 49．9±3．6*△ 50．8±2．9*△第 6周 (術(shù)后二周) 30．0±2．0 60．9±5．2▲ 34．0±1．7▲#平均右心室壓基線水平 12．2±1．1 12．1±1．2 12．0±1．3第 4 周 (術(shù)前 ) 12．0±1．2 20．8±2．0*△ 21．1±1．8*△第 6周 (術(shù)后二周) 12．3±1．4 26．4±1．2▲ 16．0±1．5▲#肺動(dòng)脈收縮壓基線水平 26．0±1．9 25．7±1．6 26．4±1．4第 4 周 (術(shù)前 ) 26．6±1．6 48．4±3．8*△ 50．6±4．0*△第 6周 (術(shù)后二周) 26．7±1．4 61．0±3．9▲ 31．0±1．7▲#

2.2 三組大鼠肺小動(dòng)脈中層壁厚占外徑的百分比及形態(tài)學(xué)比較（圖1）

三組大鼠肺小動(dòng)脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，假手術(shù)組肺小動(dòng)脈中層平滑肌厚度明顯增厚[（39.7%±3.3%）vs（ 22.3%±1.5%），P＜0.01]； 與 假 手 術(shù) 組 相比，手術(shù)組的肺小動(dòng)脈中層平滑肌厚度明顯減輕[（30.8%±2.1%） vs （39.7%±3.3%），P＜0.01]。三組大鼠肺小動(dòng)脈EVG和SMA-VWF染色結(jié)果顯示:對(duì)照組肺小動(dòng)脈管壁清楚菲薄，血管內(nèi)皮扁平；假手術(shù)組肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄甚至閉塞，平滑肌細(xì)胞增生，血管內(nèi)皮肥厚，重構(gòu)特征明顯；手術(shù)組肺小動(dòng)脈管壁清楚，管腔不狹窄，中層平滑肌肥厚減輕（圖1）。

圖1 三組大鼠肺小動(dòng)脈彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色和肺動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白-內(nèi)皮細(xì)胞染色

2.3 三組大鼠右心室肥厚指數(shù)（表2）及右心室心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（圖2）

研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，假手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞橫截面積和RVHI明顯增大（P均＜0.01）；與假手術(shù)組相比，手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞橫截面積明顯減小、RVHI明顯降低（P均＜ 0.01）（表2）。右心室心肌細(xì)胞膜染色顯示，與對(duì)照組相比，假手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞明顯增大肥厚；與假手術(shù)組相比，手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞明顯減小，肥厚程度減輕。

表2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞橫截面積及右心室肥厚指數(shù)的比較（±s）

表2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞橫截面積及右心室肥厚指數(shù)的比較（±s）

注：與對(duì)照組相比 *P＜0．01；與假手術(shù)組相比△P＜0．01

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=8)假手術(shù)組(n=8)手術(shù)組(n=8)右心室肥厚指數(shù) (%) 28．4±1．2 46．7±1．3* 34．4±1．0△右心室心肌細(xì)胞橫截面積 (μ m2) 128±11．0 539±19．0* 230±14．0△

圖2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞膜染色

2.4 肺動(dòng)脈周圍交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色結(jié)果（圖3）

分離大鼠肺動(dòng)脈及其周圍結(jié)締組織進(jìn)行交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色，發(fā)現(xiàn)其肺動(dòng)脈主干周圍結(jié)締組織中存在大量交感神經(jīng)分布。

圖3 肺動(dòng)脈周圍交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色

3 討論

有臨床研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)在肺動(dòng)脈高壓患者中激活[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓患者血漿去甲腎上腺素水平升高，并且與肺動(dòng)脈壓、肺血管阻力相關(guān)[14]。交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可能是肺動(dòng)脈高壓患者肺血管重塑及右心室功能障礙的促進(jìn)因素[15]。其具體機(jī)制可能是由于患者交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，血漿去甲腎上腺素水平增加，增加的去甲腎上腺素通過肺動(dòng)脈平滑肌上的α1受體介導(dǎo)了肺動(dòng)脈平滑肌的增殖失調(diào)和肺血管的異常收縮，從而導(dǎo)致肺血管重塑和肺動(dòng)脈壓力升高，進(jìn)而促成右心室后負(fù)荷增加、右心衰竭。那么，如果經(jīng)胸去除肺動(dòng)脈周圍交感神經(jīng)，是否會(huì)達(dá)到改善肺動(dòng)脈高壓患者血流動(dòng)力學(xué)，改善肺血管重構(gòu)及右心室肥厚？本實(shí)驗(yàn)中，我們通過成功構(gòu)建肺動(dòng)脈高壓大鼠，并實(shí)施這一外科手段來印證這一假設(shè)。

首先，本實(shí)驗(yàn)證明在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠，其肺動(dòng)脈主干周圍結(jié)締組織中存在大量交感神經(jīng)纖維。而這為肺動(dòng)脈高壓中交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活提供了基礎(chǔ)。在切除這部分結(jié)締組織后，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組的右心室收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓力明顯下降，而且隨著肺動(dòng)脈壓力的下降，手術(shù)組的肺小動(dòng)脈中層平滑肌厚度明顯減輕，右心室心肌細(xì)胞橫截面積和RVHI明顯減小，肺血管重構(gòu)和右心室肥厚明顯改善。與經(jīng)皮肺動(dòng)脈去神經(jīng)術(shù)相比，由于本研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺動(dòng)脈周圍交感神經(jīng)主要分布在肺動(dòng)脈壁外的結(jié)締組織中，所以經(jīng)胸手術(shù)切除這些富含交感神經(jīng)的結(jié)締組織可以更加徹底地實(shí)現(xiàn)肺動(dòng)脈去神經(jīng)化的目的，加強(qiáng)了手術(shù)效果。此外，該外科干預(yù)手段可避免導(dǎo)管射頻消融對(duì)消融處肺動(dòng)脈內(nèi)皮的炎癥性損傷。

雖然本研究首次證明經(jīng)胸肺動(dòng)脈去神經(jīng)支配術(shù)可以有效降低野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的肺動(dòng)脈壓力，改善其肺動(dòng)脈重構(gòu)及右心室肥厚，為臨床干預(yù)和治療肺動(dòng)脈高壓提供了新的潛在方向，但依然存在一些局限性。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用野百合堿制作了肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，野百合堿通過選擇性損傷肺血管內(nèi)皮，引起慢性血管炎性病變，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和肺血管重構(gòu)[16]，這一定程度模擬了臨床上特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的模型，但該手術(shù)對(duì)于其它病因所致的肺動(dòng)脈高壓是否有效仍需進(jìn)一步探索。同時(shí)由于缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，我們并未檢測三組大鼠心排量和肺動(dòng)脈阻力，從而沒能全面反映各組大鼠的心功能狀態(tài)和肺血管阻力。此外，這一外科手段對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠的治療作用，其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

[1]Chin KM, Rubin LJ. Pulmonary arterial hypertension [J]. J Am Coll Cardiol, 2008, 51 (16): 1527-1538. DOI: 10. 1016/j. jacc. 2008. 01.024.

[2]Hansmann G. Pulmonary hypertension in infants, children, and young adults[J]. J Am Coll Cardiol, 2017, 69 (20): 2551-2569. DOI: 10.1016/j. jacc. 2017. 03. 575.

[3]Farber HW, Loscalzo J. Pulmonary arterial hypertension[J]. N Engl J Med, 2004, 351 (16): 1655-1665. DOI: 10. 1056/NEJMra035488.

[4]楊濤, 何建國. 對(duì)肺動(dòng)脈高壓患者的管理應(yīng)有一套完整的策略—2009 年歐洲肺動(dòng)脈高壓診斷和治療指南解讀[J]. 中國循環(huán)雜志,2012, 27（Supplment）: 81-86. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614.2012.

[5]羅鵬, 黃石安, 何建國. 動(dòng)脈型肺動(dòng)脈高壓靶向藥物治療的中國證據(jù)[J]. 中國循環(huán)雜志. 2014, 29（7）: 552-554. DOI: 10. 3969/j.issn. 1000-3614. 2014. 07. 019.

[6]Velez-Roa S, Ciarka A, Najem B, et al. Increased sympathetic nerve activity in pulmonary artery hypertension[J]. Circulation, 2004,110(10): 1308-1312. DOI: 10. 1161/01. CIR. 0000140724. 90898. D3.

[7]Ciarka A, Doan V, Velez-Roa S, et al. Prognostic significance of sympathetic nervous system activation in pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2010, 11(11): 1269-1275.DOI: 10. 1164/rccm. 200912-1856OC.

[8]Mak S, Witte KK, Al-Hesayen A, et al. Cardiac sympathetic activation in patients with pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2012, 302 (10): R1153-1157. DOI: 10.1152/ajpregu. 00652. 2011.

[9]de Man FS, Handoko ML, Guignabert C, et al. Neurohormonal axis in patients with pulmonary arterial hypertension: friend or foe?[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(1): 14-9. DOI: 10. 1164/rccm.201209-1663PP.

[10]Chen SL, Zhang YJ, Zhou L, et al. Percutaneous pulmonary artery denervation completely abolishes experimental pulmonary arterial hypertension in vivo[J]. Euro Intervention, 2013, 9(2): 269-276. DOI:10. 4244/EIJV9I2A43.

[11]Chen SL, Zhang FF, Xu J, et al. Pulmonary artery denervation to treat pulmonary arterial hypertension: the single-center, prospective, firstin-man PADN-1 study (first-in-man pulmonary artery denervation for treatment of pulmonary artery hypertension)[J]. J Am Coll Cardiol,2013, 62(12): 1092-1100. DOI: 10. 1016/j. jacc. 2013. 05. 075.

[12]Chen SL, Zhang H, Xie DJ, et al. Hemodynamic, functional, and clinical responses to pulmonary artery denervation in patients with pulmonary arterial hypertension of different causes: phase Ⅱ results from the Pulmonary Artery Denervation-1 study[J]. Circ Cardiovasc Interv, 2015, 8(11): e002837. DOI: 10. 1161/CIRCINTERVENTIONS.115. 002837.

[13]Nagaya N, Nishikimi T, Uematsu M, et al. Plasma brain natriuretic peptide as a prognostic indicator in patients with primary pulmonary hypertension[J]. Circulation, 2000, 102 (8): 865-870. DOI: 10.1161/01. cir. 102. 8. 865.

[14]Nootens M, Kaufmann E, Rector T, et al. Neurohormonal activation in patients with right ventricular failure from pulmonary hypertension:relation to hemodynamic variables and endothelin levels[J]. J Am Coll Cardiol, 1995, 26 (7): 1581-1585. DOI: 10. 1016/0735-1097(95)00399-1.

[15]Maron BA, Leopold JA. Emerging concepts in the molecular basis of pulmonary arterial hypertension: part Ⅱ: neurohormonal signaling contributes to the pulmonary vascular and right ventricular pathophenotype of pulmonary arterial hypertension[J]. Circulation,2015, 131 (23): 2079-2091. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 114.006980.

[16]Hill NS, Gillespie MN, McMurtry IF. Fifty years of monocrotalineinduced pulmonary hypertension: what has it meant to the field? [J].Chest, 2017, 152 (6): 1106-1108. DOI: 10. 1016/j. chest. 2017. 10.007.