呂殷婷 焦舉 楊婷 鄒瓊 江淑琴 張勇

前列腺癌是全球第二常見的男性惡性腫瘤[1]。雖然前列腺癌可以早期診斷及治療，但仍然是全世界男性癌癥死亡的第六大原因[2]。目前，針對(duì)前列腺癌治療的方式主要有手術(shù)切除、放射治療、內(nèi)分泌治療等幾大類[3]。然而，大多數(shù)前列腺癌在去勢手術(shù)治療后2年內(nèi)最終將轉(zhuǎn)化為去勢抵抗型前列腺癌，亦稱為難治性前列腺癌(CRPC)。近年來，許多研究者提出了“前列腺腫瘤干細(xì)胞(PCSC)”的概念，認(rèn)為這可能是前列腺癌的細(xì)胞起源，并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、去勢抵抗及耐藥等多個(gè)方面發(fā)揮作用[4]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性的細(xì)胞，其特性還包括具有分化潛能、高致瘤性等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，從前列腺移植瘤中獲取的CD44+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。CD44是一種細(xì)胞表面分子，在細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤遷移進(jìn)展等多方面有重要作用，也被公認(rèn)為是細(xì)胞具有干性傾向的分子標(biāo)志。本研究選取人前列腺癌DU-145細(xì)胞進(jìn)行無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，從而富集、分離腫瘤干細(xì)胞并鑒定其特性，以期利用一種簡單、快捷、有效的方法實(shí)現(xiàn)前列腺腫瘤干細(xì)胞的制備，為后續(xù)更多針對(duì)前列腺癌干細(xì)胞靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材 料

人前列腺癌LNCaP、DU-145細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司。青霉素鏈霉素混合液、0.05%胰酶(含EDTA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素、B27購自美國Sigma公司。人重組表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購于美國PeproTech公司。胰酶抑制劑購自索萊寶公司。超低黏附6孔培養(yǎng)板購自美國Corning公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD44抗體及其同型抗體(IgG2b)、流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。CCK8增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。550型酶標(biāo)儀購自美國Bio-rad公司。4～6周齡的NOD-SCID雄性裸鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理要求。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將RPMI-1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液制備成含血清培養(yǎng)基(SSM)。將體積分?jǐn)?shù)2% B27、0.4%BSA、5 μg/ml胰島素、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF加入DMEM/F12培養(yǎng)基制備成無血清培養(yǎng)基(SFM)。DU-145細(xì)胞在SSM中培養(yǎng)時(shí)，每2 d進(jìn)行細(xì)胞換液或傳代；在SFM中培養(yǎng)時(shí)，每日觀察懸浮細(xì)胞生長情況并輕搖晃培養(yǎng)瓶避免細(xì)胞貼壁，每3 d進(jìn)行細(xì)胞換液，每7 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加入1 ml胰酶共孵育2 min后，加入2 ml胰酶抑制劑(或SSM)終止消化，后繼續(xù)按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況。

2.LNCaP、DU-145細(xì)胞中CD44+表達(dá)情況的檢測

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞和DU-145細(xì)胞，分別以1×106個(gè)重懸于100 μl PBS溶液中，2種細(xì)胞各制備3管，分別為空白管、同型對(duì)照管(含1 μl IgG2b)、FITC-CD44抗體管(含1 μl FITC-Anti CD44)避光4 ℃反應(yīng)15 min后，加入1 ml PBS，1 000轉(zhuǎn)/分離心3 min，輕倒掉上清液后加入400 μl PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測CD44+細(xì)胞比例。

3.DU-145細(xì)胞無血清傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率的計(jì)算

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的DU-145細(xì)胞，經(jīng)40 μm孔徑細(xì)胞篩濾過，用PBS離心清洗1次以去除血清后，以3×104個(gè)/孔重新鋪板于超低黏附6孔板中，加入SFM繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。每日搖晃1次培養(yǎng)板避免細(xì)胞貼壁，每3 d換1次液，分別于第20 h、2 d、7 d、14 d在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察。以形態(tài)立體、腫瘤細(xì)胞微球直徑>60 μm定義為成球，連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值計(jì)算成球率。成球率=該視野內(nèi)成球細(xì)胞個(gè)數(shù)/該視野內(nèi)總細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

4.SSM和SFM中檢測DU-145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力

將連續(xù)在SFM中培養(yǎng)14 d后的DU-145腫瘤微球細(xì)胞用胰酶消化分離后，用SSM終止反應(yīng)，1 000 轉(zhuǎn)/分離心3 min后棄上清液，加入新鮮SSM重懸細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。收集細(xì)胞，再次用500 μl胰酶消化3 min后用1 ml胰酶抑制劑終止反應(yīng)，離心后，用新鮮SFM重懸細(xì)胞并動(dòng)態(tài)觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。

5.DU-145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力檢測

分別將DU-145細(xì)胞、DU-145腫瘤微球細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以103個(gè)/100 μl的密度在96孔板中各接種3孔，使用SSM、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每塊板設(shè)置3個(gè)含100 μl SSM但不含細(xì)胞的的空白孔，以后每隔2 d換液1次。第1～8日，每日于同一時(shí)間給一塊板加入10 μl CCK-8工作液后與細(xì)胞避光繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5 h后，利用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(OD450)，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

6.檢測DU-145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU-145細(xì)胞(6.5×105/100 μl)、DU-145腫瘤微球細(xì)胞(6.5×104/100 μl)分別消化、離心后以PBS重懸為上述密度單細(xì)胞懸液。將6只雄性NOD-SCID裸鼠稱重后隨機(jī)分為2組，每組3只。每只裸鼠注射100 μl細(xì)胞懸液和100 μl基質(zhì)膠混合液于左后腿根部皮下，動(dòng)態(tài)觀察2組裸鼠的成瘤情況，待肉眼可見腫瘤后，每5 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=(π×長徑×短徑2/6)mm3，35 d后處死裸鼠，并繪制腫瘤生長曲線。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、LNCaP細(xì)胞、DU-145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例比較

CD44+LNCaP細(xì)胞、CD44+DU-145細(xì)胞比例分別為0.4%、97.6%，見圖1。CD44+DU-145細(xì)胞比例約為CD44+LNCaP細(xì)胞的271倍。

二、DU-145細(xì)胞無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率

DU-145細(xì)胞具有干細(xì)特征的部分可以在無血清培養(yǎng)基中生存并逐漸形成懸浮細(xì)胞球：懸浮培養(yǎng)20 h時(shí)，單個(gè)細(xì)胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；懸浮培養(yǎng)第2日可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢，成球率為(14.4±7.8)%；第7日可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成，成球率為(34.2±8.7)%；懸浮培養(yǎng)第14日，成球率明顯較第7日增加，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球，成球率為(61.4±7.6)%。并且DU-145腫瘤微球細(xì)胞在經(jīng)過無血清懸浮培養(yǎng)傳代后，仍可形成與原細(xì)胞形態(tài)類似的次代并逐漸形成懸浮腫瘤微球細(xì)胞，見圖2。

三、DU-145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力

將無血清懸浮培養(yǎng)的DU-145腫瘤微球細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清中培養(yǎng)10 h，已能觀察到細(xì)胞貼壁，24 h后其伸出偽足逐漸形成單層貼壁細(xì)胞，形態(tài)與常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU-145相近，見圖3。再次將其轉(zhuǎn)入無血清懸浮培養(yǎng)，仍能在20 h后觀察到單個(gè)細(xì)胞開始出芽，形成一些懸浮細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，可觀察到典型腫瘤細(xì)胞球形成。

四、DU-145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力

DU-145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU-145細(xì)胞在鋪板后第2日的OD450分別為0.757±0.059、0.373±0.068，DU-145腫瘤微球細(xì)胞增殖能力達(dá)到普通DU-145細(xì)胞2倍左右(t=7.382，P<0.05)。從第6日開始，兩者皆進(jìn)入生長平臺(tái)期。到第8日，DU-145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU-145細(xì)胞的OD450分別為0.228±0.063、0.086±0.036，DU-145腫瘤微球細(xì)胞存活量仍高于DU-145細(xì)胞(t=3.373,P<0.05)，見圖4。

五、DU-145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU-145細(xì)胞組種植細(xì)胞的數(shù)量級(jí)是DU-145腫瘤微球細(xì)胞組的10倍，但在移植瘤細(xì)胞接種裸鼠后第10日，DU-145細(xì)胞組僅2只裸鼠可見皮下成瘤，瘤體體積(8.4±1.2)mm3，成瘤率2/3，而DU-145腫瘤微球細(xì)胞組3只裸鼠均可見皮下腫瘤形成，瘤體體積(28.1±5.9)mm3，成瘤率為3/3，DU-145腫瘤微球細(xì)胞組在第10日的瘤體體積大于DU-145細(xì)胞組(t=4.464，P<0.05)。接種后第30～35日為移植瘤快速生長期，DU-145細(xì)胞組生長速度為(69.2±20.1)mm3/d，DU-145腫瘤微球細(xì)胞組為(376.3±45.1)mm3/d，DU-145腫瘤微球細(xì)胞組生長速度達(dá)到DU-145細(xì)胞組的5倍(t=8.709，P<0.05)，見圖5A。DU-145細(xì)胞與DU-145腫瘤微球細(xì)胞移植瘤在裸鼠體內(nèi)生長35 d后活體情況見圖5B、C。

圖1 LNCaP細(xì)胞、DU-145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

A、B：LNCaP細(xì)胞；C、D：DU-145細(xì)胞

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)懸浮培養(yǎng)DU-145細(xì)胞腫瘤微球細(xì)胞形成情況(×100)

A：懸浮培養(yǎng)20 h時(shí)，單個(gè)細(xì)胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；B：懸浮培養(yǎng)第2日，可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢；C：懸浮培養(yǎng)第7日，可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成；D：懸浮培養(yǎng)第14日，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球；標(biāo)尺=60 μm

圖3 DU-145腫瘤微球細(xì)胞、DU-145細(xì)胞在SMM中培養(yǎng)2 d的形態(tài)對(duì)比(×100)

A：DU-145腫瘤微球細(xì)胞；B: DU-145細(xì)胞

圖4 DU-145細(xì)胞與DU-145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力比較

圖5 DU-145細(xì)胞與DU-145腫瘤微球細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力比較

A：接種DU-145細(xì)胞與DU-145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的移植瘤體積增長曲線；B：DU-145細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35 d生長情況，紅色箭頭為裸鼠皮下成瘤處；C：DU-145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35 d生長情況

討 論

近年來，研究者們已在多種腫瘤中分離并證實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞[6-7]。在既往關(guān)于前列腺癌治療的相關(guān)報(bào)道中，基本是以前列腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)外研究。然而越來越多的研究表明，前列腺腫瘤干細(xì)胞才是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源。為此，本研究通過簡單易行的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法富集、分離前列腺腫瘤干細(xì)胞，并證明了其腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性，以期為針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的診斷及治療研究奠定基礎(chǔ)。雖然，免疫磁珠分選法和流式分選法也是為研究者們所熟知的分選、富集腫瘤干細(xì)胞的另外2種常見方法。但是，這2種方法相較于本研究所使用的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法，對(duì)科研設(shè)備要求更高，費(fèi)用也較為昂貴，例如利用免疫磁珠法分選CD44+DU-145細(xì)胞需要合適的磁場，以及同時(shí)制備大量的DU-145細(xì)胞(108數(shù)量級(jí))進(jìn)行分選，對(duì)研究實(shí)驗(yàn)要求較高[8]。若利用流式分選法進(jìn)行CD44+DU-145細(xì)胞分選，由于流式細(xì)胞儀分選通道較長易造成細(xì)胞污染，且分選步驟復(fù)雜容易損傷細(xì)胞活性，分選得到的細(xì)胞難以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。

雖然既往研究顯示，CD44分子仍表達(dá)于結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞[10-11]。但本研究選用的是CD44+人前列腺癌DU-145細(xì)胞系，研究對(duì)象為前列腺癌，并通過無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式富集得到了具有干性特征的前列腺腫瘤細(xì)胞。因此，這與CD44不僅表達(dá)在前列腺腫瘤干細(xì)胞的特性并不沖突。

研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細(xì)胞株如 LNCaP、DU145及PC-3 中，CD44+細(xì)胞比 CD44-細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖及成瘤的能力。 Ugolkov 等[12]指出，在前列腺癌組織中CD44+細(xì)胞約占72%，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往干細(xì)胞僅占據(jù)組織細(xì)胞很小比例的認(rèn)識(shí)。本研究中，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示DU-145細(xì)胞系中CD44+細(xì)胞約占97.6%，與Ugolkov等的觀點(diǎn)相符。

綜上所述，本研究通過對(duì)DU-145細(xì)胞系連續(xù)傳代無血清培養(yǎng)富集、分離得到了具有干性特征的腫瘤細(xì)胞。這對(duì)于腫瘤干細(xì)胞這一類較難獲取細(xì)胞具有重要意義。同時(shí)，本研究也對(duì)前列腺癌治療的相關(guān)研究，特別是對(duì)去勢難治性前列腺癌的治療提供了一種新的靶向治療思路，即針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，從根源上治療前列腺癌。針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的研究極具前景，本研究團(tuán)隊(duì)將以此研究為基礎(chǔ)，今后繼續(xù)開展針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞靶向診斷及治療的相關(guān)研究，進(jìn)而為前列腺癌的基礎(chǔ)研究提供一定的支持或參考。

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