盧建 王繼成 姚翠澤 張艷霞 劉玲 駱明勇 秦丹卿

血紅蛋白病是一類由于血紅蛋白結(jié)構(gòu)異?；蛘吆铣闪坎蛔阋鸬倪z傳性疾病，該病主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國(guó)多見(jiàn)于廣東、廣西和海南等南方地區(qū)[1]。血紅蛋白病可分為兩種：第一種是由α-或β-珠蛋白合成量不足引起的疾病稱為地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)；第二種是由珠蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的疾病稱為異常血紅蛋白。我國(guó)80年代對(duì)全國(guó)20個(gè)省市進(jìn)行了大規(guī)模血紅蛋白病的調(diào)查，顯示我國(guó)的南方為異常血紅蛋白高發(fā)區(qū)，其中Hb K是廣東省第二常見(jiàn)的β-珠蛋白鏈異常血紅蛋白病，僅次于Hb E[2]。Hb New York是由β-珠蛋白鏈上的點(diǎn)突變引起的異常血紅蛋白，在血紅蛋白電泳中多見(jiàn)于K組，是Hb K最常見(jiàn)的類型。Hb New York自1967年首次被發(fā)現(xiàn)是在紐約的一個(gè)祖籍廣東的華裔美國(guó)人的家庭中，隨后陸續(xù)在中國(guó)和東南亞也被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[3-5]。但對(duì)于Hb New York的臨床特征的分析，尤其是合并地貧時(shí)的血液學(xué)表現(xiàn)的報(bào)道還比較少。我們收集了34例基因診斷為Hb New York的病例并對(duì)其進(jìn)行分析，報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2015年至2017年于廣東省婦幼保健院就診，血紅蛋白電泳顯示有Hb K且經(jīng)基因檢測(cè)確診為Hb New York的34例患者。所有患者均為廣東籍居民，年齡為19～48歲，平均為29.7歲。取其外周血用于血常規(guī)和血紅蛋白電泳分析，提取外周血DNA用于珠蛋白基因檢測(cè)。

二、方 法

1.血液學(xué)分析

使用EDTA-K2采血管采集受檢者外周靜脈血，應(yīng)用Sysm ex X S.1000i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本希森美康株式會(huì)社)完成包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白量及MCV、MCH等紅細(xì)胞指數(shù)的分析。采用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(Capillar 2，法國(guó)Sebia公司)進(jìn)行血紅蛋白的分析。以上實(shí)驗(yàn)均按照儀器使用說(shuō)明書操作。

2.常規(guī)珠蛋白基因診斷

應(yīng)用廈門致善生物公司生產(chǎn)的磁珠法基因組DNA提取試劑盒和自動(dòng)化儀器(Lab-Aid 820)提取所有病例的外周血基因組DNA。采用亞能生物技術(shù)有限公司(深圳)提供的α-和β-地貧基因檢測(cè)試劑盒(gap-PCR和PCR-RDB方法)對(duì)所有DNA標(biāo)本進(jìn)行地貧基因檢測(cè)。檢測(cè)范圍包括α-地貧3種常見(jiàn)缺失類型(-α3.7/、-α4.2/、--SEA/)和3種點(diǎn)突變類型(αQSα/、αCSα/、αWSα/)以及17種β-地貧的點(diǎn)突變。

3.β-珠蛋白基因測(cè)序

對(duì)β-珠蛋白基因(HBB)全長(zhǎng)約2 kb分成3個(gè)片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和基因測(cè)序。PCR引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增體系為30 μl：15 μl的Premix LA,10 pmol/μl的引物各2 μl,4 μl基因組DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司，使用美國(guó)ABI3100 DNA測(cè)序儀雙向測(cè)序。

表1 β-珠蛋白基因測(cè)序引物序列

結(jié) 果

一、異常血紅蛋白Hb New York患者血液學(xué)表型分析結(jié)果

34例患者中，25例單純的Hb New York雜合子病例的血液學(xué)表現(xiàn)差別不大，血紅蛋白電泳提示43.9%～52.0%的Hb K異常帶；1例為Hb New York合并β0-地貧，表現(xiàn)為明顯降低的紅細(xì)胞參數(shù)和升高的Hb K(91.8%)；8例為Hb New York合并α-地貧，其血液學(xué)也有不同的改變。詳細(xì)的血常規(guī)和血紅蛋白電泳結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

二、基因檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)常規(guī)地貧基因檢測(cè)方法(gap-PCR和PCR-RDB)的檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)5例基因型為--/αα，2例基因型為-α3.7/αα，1例基因型為αwsα/αα，以及一例β17/N。β-珠蛋白基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)34例患者均檢測(cè)到HBB:c.341 T>A(CD113 GTG>GAG)雜合突變(見(jiàn)圖2A)。查詢血紅蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://globin.cse.psu.edu/)可知此突變?yōu)镠b New York。此外一病例還檢測(cè)到HBB:c.52 A>T(CD 17 AAG>TAG)雜合突變(見(jiàn)圖2B)，與以上地貧常規(guī)檢查方法檢測(cè)結(jié)果相符，為Hb New York合并β17地貧患者。

討 論

能引起珠蛋白功能改變的異常血紅蛋白包括地中海貧血樣變異、溶血性異常血紅蛋白和氧親和力異常性異常血紅蛋白病。這些異常血紅蛋白在單獨(dú)存在或復(fù)合地貧時(shí)，可表現(xiàn)為中間型或重型地貧[6]。目前常用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和sebia capillary方法進(jìn)行血紅蛋白分析并發(fā)現(xiàn)特異性的異常血紅蛋白[7]。

圖1 Hb New York患者血紅蛋白電泳圖

A：?jiǎn)渭僅b New York血紅蛋白電泳圖;B:Hb New York合并β17血紅蛋白電泳圖

表2 Hb New York的血液學(xué)特征

注：MCV紅細(xì)胞平均體積，MCH紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量

圖2 Hb New York患者地貧基因檢測(cè)

A：HBB:c.341 T>A突變，即Hb New York；B：HBB:c.52 A>T突變，即β17/N

Hb New York一種血紅蛋白的變異體[β113(G15)Val → Glu， GTG>GAG]，β鏈113號(hào)位的纈氨酸位于螺旋G15位，處于β鏈分子內(nèi)部，是疏水性氨基酸。被酸性氨基酸谷氨酸取代后，影響了分子內(nèi)部的疏水性，所以Hb New York的穩(wěn)定性不如Hb A，易于降解[8]。但由于α和β接觸面有3個(gè)氨基酸，接觸面比較廣，單個(gè)氨基酸變化可能不會(huì)對(duì)其穩(wěn)定性帶來(lái)明顯的影響。所以該突變位點(diǎn)并沒(méi)有影響到血紅蛋白的生物學(xué)功能。通過(guò)對(duì)我們收集的病例進(jìn)行血液學(xué)特征分析，單純Hb New York的雜合子是無(wú)明顯的臨床癥狀的，且血液學(xué)指標(biāo)也正常，僅血紅蛋白電泳時(shí)會(huì)出現(xiàn)含量約50%的異常血紅蛋白，這與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相同[9-10]，如果不進(jìn)行基因測(cè)序，就可能就會(huì)被忽略。當(dāng)Hb New York合并α-地貧時(shí)，除血紅蛋白電泳中較高比例的Hb K外，其他血液學(xué)指標(biāo)與單純的α-地貧也是不同的。其中合并標(biāo)準(zhǔn)型(SEA)和靜止型(3.7、WS)的α-地貧也有不同的血液學(xué)表現(xiàn)。本文中一例Hb New York合并β0-地貧的患者，表現(xiàn)為輕度的小細(xì)胞低色素性貧血，這與Lee和Li等[11-12]的病例報(bào)道中無(wú)貧血的癥狀并不相同，這可能是由于本文的病例是孕婦，存在生理性貧血的可能。

雖然Hb New York沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，但其存在會(huì)干擾一些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的測(cè)定，如糖化血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)等[13]。而且值得注意的是，由于Hb New York合并β-地貧的血紅蛋白電泳檢測(cè)到的Hb A比例大幅降低，容易引起誤診為重型β-地貧。在產(chǎn)前診斷中，這類Hb New York復(fù)合β-地貧胎兒也會(huì)因?yàn)楦改赣H輕型的β-地貧表現(xiàn)，被很少關(guān)注或者忽略。因此對(duì)Hb New York及其合并其他地貧的臨床特征的認(rèn)識(shí)有助于指導(dǎo)進(jìn)一步的分子檢測(cè)和產(chǎn)前診斷，也可以為遺傳咨詢提供重要的參考價(jià)值。當(dāng)然包括本文在內(nèi)的文獻(xiàn)報(bào)道中，Hb New York合并其他地貧的病例還相對(duì)較少，今后我們將繼續(xù)收集更多的病例，以作更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的比較。

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