周珊瑤 陳睿 譚夕 佘燕玲 雷斯

氧在細(xì)胞呼吸和能量代謝中起著重要的作用。臨床上，運(yùn)動(dòng)性損傷、缺血缺氧性疾病或組織炎癥性改變常伴隨氧灌注不足或攝氧障礙，低氧環(huán)境可使組織功能進(jìn)一步下降、甚至發(fā)生萎縮或變性壞死[1-2]。近年來(lái)，程序性壞死(Necroptosis)作為非凋亡的細(xì)胞死亡信號(hào)途徑成為缺血缺氧性損傷研究的新熱點(diǎn)，越來(lái)越多研究者發(fā)現(xiàn)，程序性壞死在多系統(tǒng)缺血缺氧性損傷后的炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。相關(guān)研究表明，受體交互作用蛋白激酶1(RIP1)特異性抑制劑——壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)能顯著改善缺血缺氧性損傷，對(duì)細(xì)胞、組織的增殖分化、損傷修復(fù)功能有保護(hù)作用[4-6]。但筆者見(jiàn)Nec-1在骨骼肌缺氧損傷修復(fù)中作用的相關(guān)報(bào)道很少，故利用小鼠骨骼肌C2C12成肌細(xì)胞構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型，觀察缺氧對(duì)肌細(xì)胞的影響及Nec-1的保護(hù)作用。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，光學(xué)電子顯微鏡(美國(guó)Life Technologies公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(北京凱元信瑞儀器有限公司)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)，高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清、馬血清(美國(guó)Hyclone公司)。二氯化鈷(CoCl2)、Nec-1(德國(guó)Sigma公司)。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司)。肌細(xì)胞生成素(Myogenin，Myog)一抗(德國(guó)Merck-Millipore公司)。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)一抗(美國(guó)CST公司)。Tubulin一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(美國(guó)ABclonal公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

將C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞系置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%～100%融合時(shí)吸去完全培養(yǎng)液，使用含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，隔日換液。分化72 h后將細(xì)胞分為4組，分別加入等量培養(yǎng)基(Control組)、200 μM CoCl2(CoCl2組)、150 μM Nec-1(Nec-1組)、200 μM CoCl2+150 μM Nec-1(CoCl2+Nec-1組)。48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.光學(xué)顯微鏡下觀察肌管融合情況

加入CoCl2、Nec-1處理48 h后，在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、肌管融合情況。

3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

采用Maeker筆在培養(yǎng)板底部均勻劃線做標(biāo)記，控制細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，用200 μl槍頭沿標(biāo)記線垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，去除劃痕損傷后不貼壁的細(xì)胞，重新加入相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用顯微鏡拍照記錄不同時(shí)間段劃痕面積，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)劃痕面積。

4.細(xì)胞周期

用2%胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，制成單細(xì)胞懸液。加入70%冷乙醇500 μl固定2 h，用PBS洗去固定液，加入500 μl碘化丙啶/核糖核酸酶A(PI/RNase A)染色工作液，避光室溫孵育60 min。應(yīng)用PI染色法流式細(xì)胞分析不同處理下的C2C12細(xì)胞周期變化。

5.蛋白免疫印跡檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞組織(RIPA)裂解液，于冰上裂解30 min，4℃，12 000轉(zhuǎn)/分離心10 min。用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白含量。取30 μg蛋白，進(jìn)行電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉1 h。加入一抗于4℃孵育過(guò)夜。洗膜5次后于室溫孵育二抗。洗膜5次后，使用ECL液顯色，用天能系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。以Tubulin作為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參比較作為條帶的相對(duì)表達(dá)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、Nec-1、CoCl2對(duì)C2C12細(xì)胞肌管形成的影響

實(shí)驗(yàn)中，Control組、Nec-1組肌細(xì)胞分化情況良好，可見(jiàn)大量長(zhǎng)條狀肌管形成。經(jīng)CoCl2處理后，分化停滯，肌管萎縮、斷裂，少見(jiàn)長(zhǎng)條狀肌管形成。而加入CoCl2+Nec-1處理后，可見(jiàn)細(xì)胞分化情況較CoCl2組改善，肌管形成增多，見(jiàn)圖1。

二、Nec-1、CoCl2對(duì)Myog、MEF2A表達(dá)水平的影響

CoCl2處理可誘導(dǎo)肌生成、分化標(biāo)志基因Myog、MEF2A蛋白表達(dá)下降(P均<0.01)，加入Nec-1處理后，可逆轉(zhuǎn)CoCl2的抑制作用，上調(diào)Myog(P<0.05)及MEF2A的表達(dá)(P<0.001)，見(jiàn)圖2、表1。

圖1 處理48 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組肌細(xì)胞分化情況(×40，標(biāo)尺=1 000 μm)

A：Control組；B：CoCl2組；C：Nec-1組；D:CoCl2+Nec-1組

圖2 Nec-1對(duì)CoCl2抑制Myog、MEF2A表達(dá)的保護(hù)作用

與CoCl2組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表1 Myog、MEF2A蛋白的相對(duì)表達(dá)量 %

注：各組Myog總體比較F=26.673，P<0.001，與CoCl2組比較，aP=0.017，bP=0.003，cP<0.001；各組MEF2A總體比較F=58.927，P<0.001，與CoCl2組比較，dP<0.001

三、Nec-1、CoCl2對(duì)細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示，CoCl2組[(12.47±1.06)%]和CoCl2+Nec-1組[18.89±3.52 )%]S期細(xì)胞比例均較Control組[(35.69±2.67)%]少(P均<0.001)，但CoCl2+Nec-1組較CoCl2組多(P=0.039)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理組的細(xì)胞周期

A：Control組；B：CoCl2組；C：Nec-1組；D：CoCl2+Nec-1組；與Control組比較，**P<0.01；與CoCl2組比較，#P<0.05

四、Nec-1、CoCl2對(duì)C2C12細(xì)胞劃痕愈合的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同處理組的劃痕愈合程度不同，見(jiàn)圖4。隨時(shí)間推移，劃痕面積逐漸縮小，Control組、Nec-1組及CoCl2+Nec-1組愈合速度較快，在72 h時(shí)幾乎完全愈合，而CoCl2組愈合速度相對(duì)較慢。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，對(duì)比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的變化差異。在0 h時(shí)，各處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在24、48、72 h時(shí)，CoCl2組細(xì)胞劃痕損傷面積均大于Control組、Nec-1組(P均<0.001)；而加入Nec-1處理逆轉(zhuǎn)了CoCl2引起的細(xì)胞損傷，CoCl2+Nec-1組劃痕損傷面積減小，劃痕愈合程度較CoCl2組高(P<0.001)，見(jiàn)表2、圖5。

表2 各處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕損傷面積 μm2

圖5 各處理組劃痕損傷面積在不同時(shí)間的變化

同一時(shí)間點(diǎn)與CoCl2組比較， ***P<0.001

討 論

本研究采用CoCl2模擬低氧環(huán)境，觀察小鼠C2C12成肌細(xì)胞的變化。CoCl2是常用的缺氧模擬化合物，在組織中通過(guò)鈷離子競(jìng)爭(zhēng)血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與氧結(jié)合的能力，在細(xì)胞中通過(guò)抑制脯氨酰羥化酶的羥化作用，從而誘發(fā)一系列類似缺氧反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化以及損傷應(yīng)激研究中被廣泛應(yīng)用[7-8]。

通過(guò)CoCl2模擬缺氧后，可觀察到肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，肌細(xì)胞的分化標(biāo)志物Myog和MEF2A表達(dá)下調(diào)。Myog屬于生肌調(diào)節(jié)因子(MRF)家族成員，具有控制成肌細(xì)胞融合的起始，促使成肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)單核成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪思±w維的作用，是肌細(xì)胞終末分化的決定因素[9]。本課題組的前期研究也顯示，MRF的表達(dá)對(duì)肌細(xì)胞的分化、融合有重要的作用[10]。Myog具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH)結(jié)構(gòu)，MEF2的MADS-box區(qū)域可與bHLH相互作用，從而激活Myog的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。本研究結(jié)果提示，CoCl2模擬缺氧可抑制肌細(xì)胞的分化。

缺氧可使多種細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，并使其代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，并出現(xiàn)凋亡、壞死、自噬、程序性壞死等[7-8, 11]。本研究結(jié)果顯示，CoCl2誘導(dǎo)可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，劃痕損傷修復(fù)能力減弱，推測(cè)缺氧對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。此外，亦有文獻(xiàn)報(bào)道，短時(shí)間或低劑量的缺氧環(huán)境可激活細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)等因子的表達(dá)量，減少細(xì)胞凋亡、加速細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)修復(fù)[12-13]。

近年來(lái)，程序性壞死是細(xì)胞死亡領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，具有壞死的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)和自噬的活化，主動(dòng)耗損能量，且能被一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路高度調(diào)控[14]。有研究表明，CoCl2誘導(dǎo)缺氧能使程序性壞死活化[15-16]。Nec-1是程序性壞死的特異性抑制劑，文獻(xiàn)報(bào)道Nec-1可改善缺血缺氧損傷，通過(guò)抑制程序性壞死對(duì)缺血缺氧模型的腦、肝、心肌組織具有保護(hù)作用，減少病理?yè)p傷，促進(jìn)組織的損傷修復(fù)，對(duì)臨床治療指導(dǎo)意義重大[14, 17-19]。本研究結(jié)果顯示，與CoCl2處理組相比，加入Nec-1干預(yù)能使細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，Myog、MEF2A蛋白表達(dá)水平上調(diào)，S期細(xì)胞比例上升，劃痕實(shí)驗(yàn)后的損傷面積修復(fù)能力改善，說(shuō)明Nec-1在缺氧條件下對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖分化有保護(hù)作用。由此推測(cè)，Nec-1可能通過(guò)抑制肌細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，從而逆轉(zhuǎn)缺氧狀態(tài)對(duì)細(xì)胞增殖分化的損害。

綜上所述，CoCl2模擬缺氧可誘導(dǎo)肌細(xì)胞損傷，抑制其增殖、分化功能，Nec-1對(duì)缺氧條件下的肌細(xì)胞損傷修復(fù)有保護(hù)作用，可能通過(guò)抑制程序性壞死來(lái)促進(jìn)肌細(xì)胞的損傷修復(fù)。然而，本研究?jī)H驗(yàn)證了Nec-1對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)缺氧下的骨骼肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，缺乏對(duì)物理缺氧模型的研究，未來(lái)將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討其在物理缺氧的體內(nèi)外模型的作用，研究Nec-1的藥理作用及機(jī)制，為肌組織缺氧損傷相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

[1] Kawamura I, Takemura G, Kanamori H, Takeyama T, Kawaguchi T, Tsujimoto A, Goto K, Maruyama R, Watanabe T, Shiraki T, Aoyama T, Fujiwara T, Fujiwara H, Minatoguchi S. Repeated phlebotomy augments angiogenesis to improve blood flow in murine ischemic legs. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010,299(2):H372-H378.

[2] 葉偉鳳, 陳亮, 熊敏, 付曉燕, 汪建. 不同缺氧方式對(duì)大鼠缺氧誘導(dǎo)因子-1α及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)和認(rèn)知功能影響. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2017，30(6):569-573.

[3] Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol, 2005,1(2):112-119.

[4] 米明珊, 鮑劍峰, 許勇, 張偉波, 杜鵬, 彭興國(guó), 任磊. 程序性壞死特異性抑制劑-1促進(jìn)大鼠脊髓損傷修復(fù)的研究. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2015,32(9):2214-2216.

[5] 支中文,楊龍,杜波,周延龍,耿德勤,程言博. Necrostatin-1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥因子的影響. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2015,14(8):757-763.

[6] 歐陽(yáng)資章, 劉曉萍, 江晟, 鐘志華, 肖誠(chéng)胤, 鄧惠容. Nec-1對(duì)于環(huán)孢素A導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用與機(jī)制研究. 中國(guó)生化藥物雜志, 2017,11(7):1005-1678.

[7] Mohamed AS, Hanafi NI, Sheikh Abdul Kadir SH, Md Noor J, Abdul Hamid Hasani N, Ab Rahim S, Siran R. Ursodeoxycholic acid protects cardiomyocytes against cobalt chloride induced hypoxia by regulating transcriptional mediator of cells stress hypoxia inducible factor 1α and p53 protein. Cell Biochem Funct, 2017,35(7):453-463.

[8] He F, Wu Q, Xu B, Wang X, Wu J, Huang L, Cheng J. Suppression of Stim1 reduced intracellular calcium concentration and attenuated hypoxia/reoxygenation induced apoptosis in H9C2 cells. Biosci Rep, 2017,37(6):R20171249.

[9] 李碩, 郝斐, 吳海青, 畢兆偉, 張志鵬, 劉東軍, 倉(cāng)明. 山羊MyoG啟動(dòng)子的克隆和活性檢測(cè). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014，47(5):984-994.

[10] 陳睿, 佘燕玲, 周珊瑤, 史華彩, 黎程. TNF-α與ERK1/2在心臟毒素誘導(dǎo)的肌損傷再生修復(fù)中的作用研究. 新醫(yī)學(xué), 2016,47(4):231-236.

[11] Chen R, Jiang T, She Y, Xu J, Li C, Zhou S, Shen H, Shi H, Liu S. Effects of cobalt chloride, a hypoxia-mimetic agent, on autophagy and atrophy in skeletal C2C12 myotubes. Biomed Res Int, 2017，2017:7097580.

[12] Akeno N, Czyzyk-Krzeska MF, Gross TS, Clemens TL. Hypoxia induces vascular endothelial growth factor gene transcription in human osteoblast-like cells through the hypoxia-inducible factor-2alpha. Endocrinology, 2001,142(2):959-962.

[13] 孫崇毅, 姚猛, 劉慶鵬, 吉光榮, 王巖松. 缺氧培養(yǎng)對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖影響及其機(jī)制的研究. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2006，6(11):18-19.

[14] Yang R, Hu K, Chen J, Zhu S, Li L, Lu H, Li P, Dong R. Necrostatin-1 protects hippocampal neurons against ischemia/reperfusion injury via the RIP3/DAXX signaling pathway in rats. Neurosci Lett, 2017,651:207-215.

[15] Wang HY, Zhang B. Cobalt chloride induces necroptosis in human colon cancer HT-29 cells. Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16(6):2569-2574.

[16] Rovetta F, Stacchiotti A, Faggi F, Catalani S, Apostoli P, Fanzani A, Aleo MF. Cobalt triggers necrotic cell death and atrophy in skeletal C2C12 myotubes. Toxicol Appl Pharmacol, 2013,271(2):196-205.

[17] Ito K, Eguchi Y, Imagawa Y, Akai S, Mochizuki H, Tsujimoto Y. MPP+ induces necrostatin-1- and ferrostatin-1-sensitive necrotic death of neuronal SH-SY5Y cells. Cell Death Discov, 2017,3:17013.

[18] Kim SJ, Lee SM. Necrostatin-1 protects against D-galactosamine and lipopolysaccharide-induced hepatic injury by preventing TLR4 and RAGE signaling. Inflammation，2017，40(6):1912-1923.

[19] Geng F, Yin H, Li Z, Li Q, He C, Wang Z, Yu J. Quantitative analysis of necrostatin-1, a necroptosis inhibitor by LC-MS/MS and the study of its pharmacokinetics and bioavailability. Biomed Pharmacother，2017，95:1479-1485.