楊茜，馬瓊，曾慶春，吳觀迪，鄭韻儀，賴文巖，許頂立

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515；2器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病(CAVD)是一種以瓣膜內(nèi)大量鈣質(zhì)沉積為特征的老年人常見的心臟瓣膜病變。CAVD包括主動(dòng)脈瓣鈣化與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄，是一種慢性進(jìn)展性疾病，其主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣進(jìn)行性增厚鈣化、活動(dòng)受限、左心室流出道梗阻、心功能不全乃至心力衰竭[1]。組織病理學(xué)研究[2～6]顯示，早期CAVD的病變機(jī)制可能與動(dòng)脈粥樣硬化類似，符合經(jīng)典的“損傷應(yīng)答假說”，而晚期則與骨形成過程相似。長期持續(xù)的高糖血癥可使體內(nèi)的LDL發(fā)生非酶化反應(yīng)，最終形成晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)修飾的LDL(AGE-LDL)[7]。AGE與LDL結(jié)合后可改變脂蛋白的功能，降低脂蛋白在血液循環(huán)中的清除速度，促進(jìn)炎癥細(xì)胞攝取脂蛋白，最終導(dǎo)致組織損傷[8，9]。已有研究[10]表明，代謝綜合征、糖尿病與主動(dòng)脈鈣化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這些患者的血漿和組織中AGE水平顯著增加，推測(cè)AGE-LDL在主動(dòng)脈瓣膜鈣化反應(yīng)中可能起重要作用，可能作為監(jiān)測(cè)CAVD的有效指標(biāo)。本研究觀察了AGE-LDL對(duì)人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(HAVICs)鈣化和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 瓣膜組織與主要實(shí)驗(yàn)材料 非CAVD瓣膜組織(non-CAVD組)取自手術(shù)治療的主動(dòng)脈瓣脫垂患者(男4例、女2例)；CAVD瓣膜組織(CAVD組)取自因鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄而進(jìn)行主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)的患者(男5例、女3例)。采用免疫組化法檢測(cè)CAVD組和non-CAVD組瓣膜組織中的AGE，CAVD組AGE表達(dá)水平較non-CAVD組明顯增高(見圖1)。胎牛血清、M199培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶購于美國Gibco公司。人LDL購于廣州奕源生物科技有限公司。膠原酶Ⅰ、人血清白蛋白(HSA)、D-葡萄糖、二甲基亞砜(DMSO)、茜素紅購于美國Sigma公司。鱟試劑購于湛江安度斯生物有限公司。細(xì)胞裂解液、BCA檢測(cè)試劑盒、青霉素G、鏈霉素均購于北京碧云天有限公司。兔抗人ICAM-1抗體購于美國Santa Cruz公司。兔抗人IL-6抗體購于美國Abcam公司。兔抗人β-actin購于美國Santa Cruz公司。HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體IgG、ECL發(fā)光液購于杭州弗德生物有限公司。IL-8的ELISA試劑盒均購于R&D system。IL-6的ELISA試劑盒購于美國Abcam公司。

圖1 CAVD組與non-CAVD組瓣膜組織中AGE表達(dá)

1.2 無內(nèi)毒素AGE-HSA與AGE-LDL的制備與鑒定 參考文獻(xiàn)[11]方法，將2 mg/mL的LDL、0.2 mol/L的D-葡萄糖及抗氧化劑(1 mg/mL的EDTA和10 μmol/L的BHT)混合均勻，無菌氮?dú)鈼l件下37 ℃孵育4周，制備AGE-HSA。將1.75 g/L純化的HSA分別置于含或不含0.1 mol/L D-葡萄糖的0.4 mol/L的PBS中，37 ℃孵育8周，制備AGE-LDL。AGE-LDL和AGE-HSA分別在4 ℃、pH 7.4無內(nèi)毒素的PBS中透析24 h，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌消毒后4 ℃保存。熒光分光光度計(jì)法檢測(cè)生成的AGE(AGE-LDL中AGE水平為6.34±0.56，LDL中AGE水平為1.00±0.49，P<0.05)。所有制備的AGE-LDL、LDL、AGE-HSA和未經(jīng)修飾的HSA經(jīng)鱟試驗(yàn)法檢測(cè)內(nèi)毒素含量均低于0.25 EU/mL。

1.3 HAVICs的分離、分組及AGE-LDL處理方法 取non-CAVD組的主動(dòng)脈瓣膜組織，去除周圍肌肉組織，冰凍無菌生理鹽水浸泡；用PBS清洗5遍，把瓣膜組織剪成小塊；把組織轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管，通過膠原酶溶液序貫消化、離心、洗滌、轉(zhuǎn)移、再離心和收集，最后用M199培養(yǎng)液重懸，把懸浮液轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%融合時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞饑餓24 h，隨機(jī)分為對(duì)照組、LDL組、AGE-HSA組和AGE-LDL組。對(duì)照組給予等體積的M199培養(yǎng)液，LDL組給予100 μg/mL的LDL，AGE-HSA組給予100 μg/mL的AGE-HSA，AGE-LDL組分別給予50、100、200 μg/mL的AGE-LDL。各組給藥48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞鈣化情況觀察 取對(duì)照組和AGE-LDL組細(xì)胞，給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，每3 d換液1次。達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，從恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄上清，用PBS清洗2遍。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20～30 min，PBS清洗2遍，0.1%茜素紅溶液染色15 min，PBS清洗2遍，在倒置顯微鏡下觀察著色情況并拍照。

1.5 各組細(xì)胞炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞中ICAM-1、IL-6蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。各組細(xì)胞給藥48 h后去上清培養(yǎng)液，用冰冷的PBS漂洗3次，加入細(xì)胞裂解液冰上靜置30 min，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，于4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清蛋白于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白40 μg，加5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，凝膠電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，PVDF膜與一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日，TBST漂洗3次，加羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，TBST漂洗3次。以β-actin為內(nèi)參，于暗室中用ECL發(fā)光液及凝膠成像分析系統(tǒng)曝光顯影，采用Image J軟件分析并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8檢測(cè) 收集各組細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，收集上清液。按ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-6、IL-8。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3～5次，取均值。

1.6 各組細(xì)胞中NF-κB磷酸化水平變化及其對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響觀察 將HAVICs饑餓24 h，用100 μg/mL的AGE-LDL分別刺激HAVICs 0.5、1、2、4、8 h，以只加DMSO的細(xì)胞作為對(duì)照，檢測(cè)HAVICs中NF-κB磷酸化水平。為觀察NF-κB信號(hào)通路去磷酸化的影響，將HAVICs隨機(jī)分為5個(gè)組，對(duì)照組給予等體積的M199培養(yǎng)液；LDL組給予100 μg/mL的LDL；DMSO組給予含有1%DMSO的M199培養(yǎng)液；AGE-LDL組給予100 μg/mL的AGE-LDL；Bay11-7082組預(yù)先給予2.5 μmol/L的Bay11-7082(NF-κB的特異性抑制劑)干預(yù)30 min，然后給予100 μg/mL的AGE-LDL。各組給藥48 h后采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中的ICAM、IL-6蛋白。

2 結(jié)果

2.1 AGE-LDL組與對(duì)照組細(xì)胞鈣化情況比較 與對(duì)照組相比，AGE-LDL組(100 μg/mL亞組)細(xì)胞中鈣鹽沉積明顯，形成鈣結(jié)節(jié)。見圖2。

圖2 AGE-LDL組與對(duì)照組細(xì)胞鈣化情況

2.2 各組細(xì)胞炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較

2.2.1 各組細(xì)胞中ICAM-1、IL-6蛋白表達(dá)比較 AGE-LDL組細(xì)胞中ICAM-1、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、LDL組、AGE-HSA組，且AGE-LDL組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組、200 μg/mL亞組中ICAM-1、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。詳見表1。

2.2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平比較 AGE-LDL組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平高于對(duì)照組、LDL組、AGE-HSA組，且AGE-LDL組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組、200 μg/mL亞組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平依次增高(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組細(xì)胞中ICAM-1、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量及培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平比較比較

2.3 各組細(xì)胞中NF-κB磷酸化水平及其對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 AGE-LDL刺激HAVICs 0.5、1、2、4、8 h后細(xì)胞NF-κB磷酸化水平分別為2.80±0.49、5.15±0.41、6.53±0.43、4.37±0.61、3.19±0.72，均高于對(duì)照組的0.37±0.17(P均<0.05)。AGE-LDL可呈時(shí)間依賴性方式刺激HAVICs中的NF-κB/p65磷酸化，于作用2 h后達(dá)到峰值，4 h后開始減弱。AGE-LDL組、Bay11-7082組細(xì)胞中ICAM、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、LDL組、DMSO組，且Bay11-7082組ICAM、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量低于AGE-LDL組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組細(xì)胞中ICAM、IL-6表達(dá)比較

3 討論

CAVD成為主要的心血管疾病之一，由于對(duì)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，目前尚無有效治療藥物，因此研究該疾病的病因、病理生理機(jī)制及探索治療靶點(diǎn)十分必要。多項(xiàng)研究[12～14]表明CAVD的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān)。AGE形成后可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度、溶解性和配位結(jié)合等性質(zhì)發(fā)生改變，在體內(nèi)可使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變，如細(xì)胞外基質(zhì)膠原粘連、增生、變厚和硬化等；同時(shí)，AGE可與血漿中的某些蛋白質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)，如與血漿LDL共價(jià)耦聯(lián)后即形成AGE-LDL[15]。脂質(zhì)代謝紊亂已經(jīng)被證實(shí)與2型糖尿病、心血管疾病、慢性腎臟病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AGE-LDL水平升高和動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)生均有關(guān)。已有研究[16，17]表明AGE-LDL不僅是機(jī)體高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂的產(chǎn)物，其本身也是一種促氧化應(yīng)激和促炎因子。炎癥反應(yīng)是骨化鈣化病變發(fā)生的基礎(chǔ)，ICAM-1等趨化因子和黏附分子能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞在瓣膜組織聚集并激活，分泌TGF-β、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管和瓣膜細(xì)胞的骨化纖維化反應(yīng)，參與瓣膜基質(zhì)重構(gòu)和鈣化形成。

本研究首先通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CAVD組AGE表達(dá)量顯著高于non-CAVD組。隨后我們分離了HAVICs并給予AGE-LDL刺激，發(fā)現(xiàn)AGE-LDL能使HAVICs發(fā)生鈣化，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加細(xì)胞鈣化程度顯著增加，培養(yǎng)21 d時(shí)己形成大量明顯的鈣化灶。我們還發(fā)現(xiàn)，AGE-LDL組細(xì)胞中ICAM-1、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量及培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平均高于對(duì)照組、LDL組、AGE-HSA組，且AGE-LDL組的50 μg/mL亞組、100 μg/mL亞組、200 μg/mL亞組ICAM-1、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量及IL-6、IL-8水平也依次增高。這表明AGE-LDL可使HAVICs中ICAM-1、IL-6蛋白表達(dá)增高，作用呈劑量依賴性；同時(shí)，AGE-LDL還可刺激HAVICs培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8水平增高。上述炎癥介質(zhì)在人主動(dòng)脈瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展中均起到重要作用[18，19]。由此可見，AGE-LDL可誘導(dǎo)HAVICs鈣化并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

NF-κB是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，它參與許多基因特別是與機(jī)體防御功能及炎癥反應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。NF-κB在細(xì)胞中發(fā)揮主要生理作用的激活形式是p50/p65蛋白亞基構(gòu)成的異源二聚體，因此通常將p50/p65異源二聚體稱為NF-κB。當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激時(shí)，在蛋白激酶和蛋白磷酸酶的參與下，IκB發(fā)生磷酸化，并從NF-κB聚體上解離，暴露p50蛋白的核定位符號(hào)，NF-κB得以激活，并移位進(jìn)入細(xì)胞核，與鏈上特異部位結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB激活后可誘導(dǎo)多種含有κB位點(diǎn)的炎癥基因表達(dá)，如IL-1、ICAM-1、TNF-ɑ。本研究中，我們使用AGE-LDL刺激HAVICs，證實(shí)AGE-LDL可以呈時(shí)間依賴性方式刺激HAVICs激活NF-κB磷酸化，于2 h后達(dá)到峰值，4 h后開始減弱。為了明確NF-κB信號(hào)通路在AGE-LDL誘導(dǎo)ICAM-1、IL-6表達(dá)中的作用，我們用NF-κB特異性抑制劑Bay11-7082抑制IκB磷酸化的作用，結(jié)果顯示Bay11-7082組ICAM、IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量低于AGE-LDL組，即抑制NF-κb信號(hào)通路能明顯抑制AGE-LDL誘導(dǎo)的ICAM-1、IL-6高表達(dá)，提示NF-κB信號(hào)通路參與了AGE-LDL誘導(dǎo)HAVICs發(fā)生炎癥反應(yīng)的過程。

根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推測(cè)AGE-LDL對(duì)HAVICs的激活作用可能是高水平AGE-LDL患者易發(fā)CAVD的原因之一。鑒于AGE-LDL在CAVD的發(fā)生和發(fā)展中的作用，若能降低患者體內(nèi)AGE-LDL的水平，則可能有助于降低并發(fā)主動(dòng)脈鈣化的概率。

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