張 魁，婁 寅，謝 娟，李紅紅，曹東升

嬰幼兒血管瘤是一種由異常增生的血管和不成熟的血管細(xì)胞組成的良性腫瘤。其生物過程概括為毛細(xì)血管的異常增生及自行消退[1]，原病灶處血管瘤組織可潰瘍出血或萎縮后形成瘢痕組織或者纖維脂肪組織[2]。近年來，嬰幼兒血管瘤干細(xì)胞(hemangiomas stem cells, HemSCs)被證實(shí)作為嬰幼兒血管瘤的起源細(xì)胞參與其生物學(xué)過程，有較高的增殖和分化能力。胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin-like growth factor 2, IGF-2)是一種小卻有多重功能的多肽，在腫瘤生長(zhǎng)及調(diào)控各種生物學(xué)功能中有重要作用[3]。已有研究證實(shí)IGF-2在脂肪形成過程中明顯上調(diào)[4]，而且IGF-2在增生期血管瘤組織中高表達(dá)[5]，IGF-2有三種受體:胰島素樣生長(zhǎng)因子-2受體(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF-2R)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)、胰島素受體(insulin receptor, IR)，其中IGF-1R主要通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)脂肪分化[6]，提示IGF-2可能通過IGF-1R參與嬰幼兒HemSCs的脂肪轉(zhuǎn)化。該研究旨在探討IGF-2是否通過IGF-1R調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路進(jìn)而影響HemSCs的成脂轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1組織來源增生期草莓狀嬰幼兒血管瘤組織標(biāo)本均來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院整形外科臨床診斷明確的患者。全部取得患者家屬同意并簽署知情同意書，術(shù)后組織標(biāo)本3例，患者術(shù)前均未經(jīng)任何治療。

1.2主要試劑與儀器膠原酶(德國(guó) Serva公司)；EGM-2培養(yǎng)基(美國(guó) LONZA公司)；CD133免疫磁珠試劑盒(德國(guó) Miltenyi生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS(美國(guó) HyClone 公司)；胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；CCK-8試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；IGF-2(美國(guó) Peprotech公司)；OSI-906(美國(guó) Selleck公司)；LY294002(美國(guó) MCE公司)；C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin抗體(中國(guó) Bioss公司)；p-AKT、total AKT抗體(美國(guó) CST公司)；MS分選器、MS分選柱(德國(guó) Miltenyi生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1HemSCs原代提取與培養(yǎng) 3例增生期草莓狀嬰幼兒血管瘤組織裝于DMEM/10% FBS+1%雙抗培養(yǎng)液的50 ml無菌離心管，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，超凈臺(tái)無菌PBS清洗3次后，無菌眼科剪分別剔除脂肪、皮膚、血凝塊及其他非血管瘤組織，殘留鮮紅色血管瘤組織團(tuán)塊，放于0.2%膠原酶中剪碎至1 mm3大小，37 ℃水浴消化2 h至乳糜狀，加基礎(chǔ)培養(yǎng)基中和，300 r/min 離心10 min,再次離心后棄上清，加DMEM重懸，100目金屬網(wǎng)過濾三次后收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每108個(gè)細(xì)胞，加300 μl滅菌PBS，100 μl FcR封閉液，100 μl CD133免疫磁珠標(biāo)記，混勻后4 ℃避光孵育30 min。安裝好分選柱無菌PBS潤(rùn)濕3次，分選柱過濾，搜集分選柱內(nèi)免疫標(biāo)記細(xì)胞再次細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，長(zhǎng)滿至80%左右傳代，3～15代內(nèi)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2CCK-8法檢測(cè)IGF-2對(duì)HemSCs增殖的影響 對(duì)數(shù)期HemSCs調(diào)整濃度至2×103/孔接種于96孔板，饑餓24 h,設(shè)置5組(EBM-2/5% FBS)：10、20、100、200 ng/ml IGF-2實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育72 h,各組加入CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm下各孔吸光度(OD)值。為進(jìn)一步研究其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，HemSCs調(diào)整濃度為1.5×103/孔，饑餓24 h,每孔加入100 ng/ml IGF-2(5% FBS), CCK-8試劑分別于第0、1、3、5、7天加入，37 ℃孵育，4 h后測(cè)490 nm下各孔OD值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。并選取合適藥物濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3Western blot檢測(cè)各組HemSCs中C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、 adiponectin及p-AKT、total AKT的蛋白表達(dá) 收集各實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量，根據(jù)蛋白濃度設(shè)定上樣量濃度，稀釋后蛋白加熱變性，經(jīng)凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h, C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin、p-AKT、total AKT抗體均按照1:1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，配制二抗1:10 000稀釋，室溫孵育1 h。每步驟之間均TBST洗膜10 min×3次。加ECL發(fā)光顯影試劑曝光后保存圖片，β-actin作為內(nèi)參，所有條帶均進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1IGF-2促進(jìn)HemSCs增殖不同濃度的IGF-2處理HemSCs后，CCK-8結(jié)果顯示：IGF-2在體外對(duì)HemSCs增殖有促進(jìn)作用。與空白對(duì)照組相比，濃度在100～200 ng/ml時(shí)對(duì)HemSCs的增殖有明顯促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.93,P<0.05)，在100 ng/ml時(shí)對(duì)HemSCs的促進(jìn)作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞在100 ng/ml組時(shí)比其他組更有活力，IGF-2處理后的細(xì)胞在第3～7天時(shí)OD值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.72,P<0.05)。見圖2。為了方便進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)組IGF-2濃度均選用100 ng/ml。

2.2IGF-2促進(jìn)HemSCs中脂肪轉(zhuǎn)化因子C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、adiponectin的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示：β-actin作為內(nèi)參，IGF-2處理72 h后，實(shí)驗(yàn)組中C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和adi-ponectin的表達(dá)增加，明顯高于空白對(duì)照組；同時(shí)IGF-2+OSI-906組、IGF-2+LY294002組、LY294002組中脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量明顯低于IGF-2組；LY294002組中脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組。見圖3。以上結(jié)果表明IGF-2在體外可促進(jìn)HemSCs向脂肪轉(zhuǎn)化。IGF-1R受體抑制劑(OSI-906)、PI3K抑制劑(LY294002)均可抑制IGF-2誘導(dǎo)的HemSCs成脂轉(zhuǎn)化。

圖1 不同濃度IGF-2對(duì)HemSCs增殖的影響

1：空白對(duì)照組；2～5：10、20、100、200 ng/ml IGF-2組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與100 ng/ml IGF-2組比較：#P<0.05

圖2 IGF-2處理后HemSCs的生長(zhǎng)曲線

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3IGF-2及IGF-1R受體抑制劑對(duì)PI3K通路的影響Western blot結(jié)果顯示，β-actin作為內(nèi)參，IGF-2組處理1 h后，實(shí)驗(yàn)組中AKT磷酸化表達(dá)增加，明顯高于空白對(duì)照組；IGF-2+OSI-906組、IGF-2+LY294002組處理后，AKT磷酸化水平明顯減少低于IGF-2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。以上結(jié)果表明IGF-2可促進(jìn)HemSCs中PI3K/AKT通路活化，IGF-1R受體抑制劑(OSI-906)可抑制PI3K/AKT通路的活化。

3 討論

1：空白對(duì)照組；2：IGF-2組；3：IGF-2+OSI-906組；4：IGF-2+LY294002組；5：LY294002組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與IGF-2組比較：#P<0.05

圖4 Western blot 法檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況

1：空白對(duì)照組；2：IGF-2組；3：IGF-2+OSI-906組；4：IGF-2+LY294002組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與IGF-2組比較：#P<0.05

嬰幼兒血管瘤是一種微血管性的良性腫瘤，大多數(shù)嬰幼兒血管瘤會(huì)隨著時(shí)間的推移而自發(fā)消退,其中消退期瘤體內(nèi)紊亂的血管和不成熟的血管細(xì)胞被纖維脂肪組織替代。HemSCs作為嬰幼兒血管瘤的起源細(xì)胞，已經(jīng)成為研究嬰幼兒血管瘤生物學(xué)特性的熱點(diǎn)[1]。在嬰幼兒血管瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)歸為纖維脂肪組織過程中，HemSCs增殖及脂肪分化的具體機(jī)制尚未明確。

IGF-2作為一種促有絲分裂原，具有凋亡抑制作用，研究者采用cDNA微集陣列分析方法證實(shí)IGF-2是血管瘤生長(zhǎng)潛在的重要調(diào)節(jié)因子，通過建立人血管瘤的外植模型，表明IGF-2可促進(jìn)血管瘤在體外生長(zhǎng)[5,7]。本研究通過CCK-8法發(fā)現(xiàn)IGF-2在體外能夠明顯增加HemSCs的增殖能力并且呈劑量依賴性。IGF-2作為調(diào)控因子在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)及各種生物學(xué)功能中，有三種受體可結(jié)合并發(fā)揮不同功能，其中IGF-2R沒有內(nèi)在的催化活性，可以作為一種膜結(jié)合IGF結(jié)合蛋白可滅活I(lǐng)GF-2[8]，IR參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持，IGF-1R可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、抑制細(xì)胞凋亡[9]。研究表明IGF-2可參與機(jī)體脂肪轉(zhuǎn)化及脂質(zhì)堆積過程[4]，同時(shí)IGF-2可促進(jìn)成年大鼠骨細(xì)胞的增殖及脂肪轉(zhuǎn)化[10]。推測(cè)IGF-2可能對(duì)HemSCs的脂肪分化有一定作用。同時(shí)脂肪生成受到轉(zhuǎn)錄因子的密切調(diào)控，包括PPAR和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)家族[11]。C/EBPs在調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化中有不同作用，C/EBPβ作為前脂肪細(xì)胞脂肪分化中遺傳級(jí)聯(lián)組成部分，可加速促進(jìn)C/EBPα的作用[12]，C/EBPα作為轉(zhuǎn)錄因子與PPARγ聯(lián)合可明顯促進(jìn)脂肪分化過程, 脂聯(lián)素(adiponectin)又通過PPARγ途徑促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化[13]。本研究Western blot結(jié)果顯示IGF-2組處理后HemSCs中脂肪轉(zhuǎn)化因子C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和 adiponectin表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，IGF-2+ OSI-906組處理后上述脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量明顯低于IGF-2組。同時(shí)，有研究[14-15]表明PI3K/AKT通路作為IGF-1R通路的下游參與脂肪轉(zhuǎn)化。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，PI3K抑制劑(LY294002)明顯抑制了脂肪細(xì)胞的分化[16]。本研究Western blot結(jié)果顯示IGF-2+LY294002組處理后上述脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量明顯低于IGF-2組，且LY294002組處理后上述脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組。為進(jìn)一步探索IGF-2及IGF-1R對(duì)PI3K/AKT通路的影響，本研究Western blot結(jié)果顯示IGF-2組處理后p-AKT表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，IGF-2+OSI-906組和IGF-2+LY294002組處理后p-AKT表達(dá)量明顯低于IGF-2組。上述研究進(jìn)一步證實(shí)了IGF-2可能通過IGF-1R調(diào)節(jié)下游PI3K/AKT通路影響HemSCs脂肪轉(zhuǎn)化。

綜上所述，IGF-2在體外可促進(jìn)嬰幼兒HemSCs的增殖及向脂肪分化，其脂肪分化的機(jī)制可能是與IGF-1R誘導(dǎo)的PI3K/AKT通路活性有關(guān)。

[1] Kilcline C, Frieden I J. Infantile hemangiomas: how common are they? A systematic review of the medical literature [J]. Pediatr Dermato, 2008, 25(2): 168-73.

[2] Cheng C E, Friedlander S F. Infantile hemangiomas, complications and treatments [J]. Semin Cutan Med Surg, 2016, 35(3): 108-16.

[3] Halje M, Nordin M, Bergman D, et al. Review: The effect of insulin-like growth factor II in the regulation of tumour cell growthinvitroand tumourigenesisinvivo[J].InVivo, 2012, 26(4): 519-26.

[4] Cha M H, Kim I C, Lee B H, et al. Baicalein inhibits adipocyte differentiation by enhancing COX-2 expression[J]. J Med Food, 2006, 9(2): 145-53.

[5] Picard A, Boscolo E, Khan Z A, et al. IGF-2 and FLT-1/VEGF-R1 mRNA levels reveal distinctions and similarities between congenital and common infantile hemangioma[J]. Pediatr Res, 2008, 63(3): 263-7.

[6] Kim S P, Ha J M, Yun S J, et al. Transcriptional activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma requires activation of both protein kinase A and Akt during adipocyte differentiation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 399(1): 55-9.

[7] Yu Y, Wylie Sears J, Boscolo E, et al. Genomic imprinting of IGF2 is maintained in infantile hemangioma despite its high level of expression[J]. Mol Med, 2004, 10(7-12): 117-23.

[8] Spicer L J, Voge J L, Allen D T, et al. Insulin-like growth factor-II stimulates steroidogenesis in cultured bovine thecal cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 2004, 227(1-2): 1-7.

[9] Hopkins A, Crowe P J, Yang J L, et al. Effect of type 1 insulin-like growth factor receptor targeted therapy on chemotherapy in human cancer and the mechanisms involved[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(5): 639-50.

[10] Madsen M S, Siersbaek R, Boergesen M, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma and C/EBPalpha synergistically activate key metabolic adipocyte genes by assisted loading[J]. Mol Cell Biol, 2014, 34(6): 939-54.

[11] Musri M M, Parrizas M. Epigenetic regulation of adipogenesis[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2012, 15(4): 342-9.

[12] Choi S K, Park S, Jang S, et al. Cascade regulation of PPARgamma(2) and C/EBPalpha signaling pathways by celastrol impairs adipocyte differentiation and stimulates lipolysis in 3T3-L1 adipocytes[J]. Metabolism, 2016, 65(5): 646-54.

[13] Adashi E Y, Resnick C E, Rosenfeld R G, et al. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-II hormonal action in cultured rat granulosa cells: mediationviatype I but not type II IGF receptors[J]. Endocrinology, 1990, 126(1): 216-22.

[14] Peng X D, Xu P Z, Chen M L, et al. Dwarfism, impaired skin development, skeletal muscle atrophy, delayed bone development, and impeded adipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2[J]. Development, 2003, 17(11): 1352-65.

[15] Jia D, Heersche J N. Insulin-like growth factor-1 and -2 stimulate osteoprogenitor proliferation and differentiation and adipocyte formation in cell populations derived from adult rat bone[J]. Bone, 2000, 27(6): 785-94.

[16] Wong A, Hardy K L, Kitajewski A M, et al. Propranolol accelerates adipogenesis in hemangioma stem cells and causes apoptosis of hemangioma endothelial cells[J]. Plast Reconstr Surg, 2012, 130(5): 1012-21.