孫 康，鐘藍(lán)海，張 楊，馬丹丹，蔡 遜，田 俊

結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移與眾多基因、分子異常表達(dá)密切相關(guān)[1]。研究[2]顯示，96序列相似的家庭成員A (family with sequence similarity 96, member A , FAM96A)在胃腸道間質(zhì)瘤中表達(dá)顯著降低，過表達(dá)FAM96A于間質(zhì)瘤細(xì)胞中，抑制細(xì)胞增殖，增加凋亡敏感性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少致瘤性，且對FAM96A功能的研究有助于開發(fā)新型間質(zhì)瘤療法。目前國內(nèi)外關(guān)于FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究報道甚少。該研究主要觀察FAM96A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異，并分析其表達(dá)差異與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征的關(guān)系，并探討其對結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集中國人民解放軍武漢總醫(yī)院普通外科2015年7月～2016年7月60例結(jié)腸癌組織標(biāo)本及距腫瘤邊緣>5 cm處為準(zhǔn)的癌旁組織標(biāo)本，離體后液氮灌暫時存放并運送至-80 ℃ 超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑FAM96A、β-actin一抗及二抗均購自英國Abcam公司； TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；總蛋白抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、MTT均購自日本Sigma公司。人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞、人正常胎肝L02細(xì)胞均保存于本院中心實驗室。β-actin F：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，R：5′-GCCAT CTCTTGCTCGAAGTC-3′；FAM96A F：5′-GCAAAGCA CGCTGGAACT-3′，R：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計并合成。本研究所需pcDNA3.1-myc-FAM96A重組質(zhì)粒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系田俊教授惠贈。

1.3Real-timePCR檢測FAM96A基因表達(dá)提取60例結(jié)腸癌組織及配對癌旁組織的總mRNA(參照TRIzol試劑盒操作說明書)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩eal-time PCR總反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Green mix緩沖液10 μl+上下游引物各0.6 μl(濃度為：10 μmol/L)+cDNA 2 μl+DEPC水6.8 μl。反應(yīng)條件為變性、退火及延伸。本實驗中，肝癌組織和細(xì)胞所用FAM96A 和β-actin引物、Real-time PCR總反應(yīng)體系和設(shè)定的反應(yīng)條件均相同，由Real-time PCR儀自動生成數(shù)據(jù)。

1.4Westernblot法檢測FAM96A蛋白表達(dá)分別稱取0.08～0.10 g結(jié)腸癌組織和配對癌旁組織，提取蛋白并定量。各組取120 μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白， 封閉一抗，標(biāo)記二抗，化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。

1.5MTT法檢測HCT116細(xì)胞活性取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，24 h后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染。分為FAM96A組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-FAM96A質(zhì)粒)和對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector空白質(zhì)粒)。酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(absorbance, A)值，繪制細(xì)胞生長曲線，其中橫縱坐標(biāo)分別為時間和A值。

1.6流式細(xì)胞儀檢測HCT116細(xì)胞凋亡將細(xì)胞收集后，按照說明書加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1FAM96A在結(jié)腸癌中的表達(dá)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：FAM96A mRNA在60例新鮮結(jié)腸癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，表達(dá)量分別為(0.376±0.169)、(1.009±0.248), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.328,P<0.05)，即FAM96A mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織。Western blot檢測結(jié)果表明：結(jié)腸癌組織及癌旁組織中均可檢測到FAM96A蛋白表達(dá)，且FAM96A在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)同樣低于癌旁組織。見圖1。

2.2FAM96A蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系FAM96A蛋白表達(dá)差異與本研究中60例結(jié)腸癌患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 FAM96A在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

臨床病理特征n表達(dá)量t值P值性別 男320.383±0.1820.3320.741 女280.368±0.156年齡(歲) <60270.400±0.1850.9960.323 ≥60330.356±0.156腫瘤大小(cm) <5260.394±0.1800.7290.469 ≥5340.362±0.161分化程度 高中290.415±0.1881.770<0.05 低310.339±0.142浸潤深度 未及漿膜250.546±0.09312.869<0.05 侵及漿膜350.254±0.082淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性300.518±0.10712.214<0.05 陽性300.234±0.070遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 陰性500.420±0.1495.497<0.05 陽性100.157±0.035TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期280.530±0.10112.768<0.05 Ⅲ～Ⅳ期320.242±0.070

2.3MTT法檢測HCT116細(xì)胞活性實驗結(jié)果表明：FAM96A組A值顯著低于對照組(P<0.05)，即過表達(dá)FAM96A可顯著抑制HCT116細(xì)胞增殖，見圖2。

圖2 HCT116細(xì)胞生長曲線

2.4流式細(xì)胞儀檢測HCT116細(xì)胞凋亡率過表達(dá)FAM96A組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組[(38.44±3.38)%vs(4.16±0.56)%，t=30.015，P<0.05]，即過表達(dá)FAM96A可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 過表達(dá)FAM96A對HCT116細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

FAM96A與FAM96B屬同源蛋白，均含有DUF59結(jié)構(gòu)域，具有50%的序列同一性，不同的是FAM96A具有預(yù)測的信號序列而FAM96B沒有，均為分子量18 ku的小分子蛋白，均通過相互作用蛋白發(fā)揮功能，具體機(jī)制不明確。研究[3]表明FAM96A與CIA2A組成蛋白復(fù)合物CIA2A-FAM96A維持細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)。目前國內(nèi)外研究[4-6]顯示：FAM96B在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)且抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116增殖并促進(jìn)凋亡，然而關(guān)于FAM96A在結(jié)腸癌中的功能研究報道甚少。因此，本研究旨在探索FAM96A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異及細(xì)胞生物學(xué)功能，以期為結(jié)腸癌診斷和治療提供新的靶點和思路。

分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)是觀察腫瘤組織及配對癌旁正常組織的差異性表達(dá)，異常表達(dá)的基因可認(rèn)為是潛在的新一類控制細(xì)胞增殖和凋亡的癌基因或抑癌基因，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。本研究中收集60例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)配對癌旁組織標(biāo)本，分別采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測FAM96A在基因和蛋白水平的表達(dá)差異。檢測結(jié)果表明：FAM96A在結(jié)腸癌組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著低于癌旁組織。由此可見, FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑癌基因特性，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。Schwamb et al[2]認(rèn)為FAM96A作為新的抑癌基因，在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的腫瘤抑制作用。本實驗結(jié)果與其研究結(jié)論基本一致。

目前結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康與生命財產(chǎn)安全[8]。導(dǎo)致結(jié)腸癌低生存率的關(guān)鍵因素在于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，其中肝臟轉(zhuǎn)移是最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。因此，如能阻斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移途徑，則能大大提高結(jié)腸癌患者的生存率。本研究通過對FAM96A蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出FAM96A在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，與結(jié)腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。提示FAM96A可能是一個與結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子指標(biāo)，在結(jié)腸癌發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵的抑制作用。

為進(jìn)一步明確FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能，本研究采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法將FAM96A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞中，觀察FAM96A基因過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。Schwamb et al[2]報道FAM96A是胞質(zhì)鐵硫蛋白簇聚集系統(tǒng)成員之一，在調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)方面起到關(guān)鍵作用。通過線粒體凋亡途徑對間質(zhì)瘤發(fā)揮促凋亡作用。過表達(dá)FAM96A可增強(qiáng)間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST882凋亡敏感性，并在體內(nèi)和體外抑制腫瘤生長，F(xiàn)AM96A低表達(dá)或表達(dá)沉默將導(dǎo)致間質(zhì)瘤的發(fā)生。同時，Ito et al[4]報道FAM96B與MMS19、Ciao 1、XPD等組成蛋白復(fù)合物MMXD，定位于紡錘體，在有絲分裂染色體正常分離中發(fā)揮關(guān)鍵作用，F(xiàn)AM96B基因沉默可導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞不能正常有絲分裂，異型細(xì)胞核堆積，細(xì)胞凋亡，是癌癥潛在的診斷和治療靶點。本研究中MTT及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示：過表達(dá)FAM96A可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞增殖，并顯著誘導(dǎo)其凋亡。證實FAM96A促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116凋亡，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明，與國外文獻(xiàn)報道基本一致。

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