金 潔，孫 成，李午麗

齲病是人類最常見的細菌感染性疾病之一。變異鏈球菌(S.mutans)是齲病的主要致病菌，其表面蛋白抗原PAc是主要的毒力因子，參與介導細菌對牙面的粘附，抗PAc特異性抗體能有效抑制S.mutans的致齲能力。研究[1]顯示，用PAc分子中特定核酸序列制備的防齲亞單位疫苗rPAc經(jīng)黏膜途徑免疫機體可以誘導機體產(chǎn)生特異性抗PAc抗體，從而達到防齲效果，但是rPAc的免疫效能還有待于提高，需要與佐劑聯(lián)合應用以增強免疫效果。目前常用的佐劑如霍亂毒素B亞單位[2]、脂質(zhì)體或AddaVax[3-4]。由于這些佐劑存在具有一定的毒副作用、制備過程繁瑣或黏膜佐劑活性低等缺點，阻礙rPAc安全方便的應用。人參皂苷Re，是人參中含量較多的活性成分之一。近年來研究[5]顯示Re具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠有效地提高抗原的免疫原性，從而增強機體的細胞和體液免疫應答，具有佐劑功能，已被用于多種疫苗研究。目前，尚未見Re應用于防齲疫苗研究的報道。該實驗研究擬在鼻腔滴注免疫途徑下，rPAc與Re聯(lián)合免疫實驗動物，檢測免疫后動物血清和唾液中特異性抗體水平及細胞因子表達的變化，觀察其對齲齒發(fā)生發(fā)展的影響，探討Re作為rPAc佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器Ni-NTA金屬鰲合親和層析柱(德國Qiagen公司)；白細胞介素4(interluekin-4，IL-4)和γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)檢測試劑盒(美國BD公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG/IgG2a/IgG1、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgA、未標記羊抗小鼠IgG、未標記羊抗小鼠IgA、小鼠標準血清(美國Bethyl公司)；人參皂苷Re(純度>98%，上海士鋒生物科技有限公司)；Detoxi-GelTM 內(nèi)毒素去除膠[賽默飛世爾科技(上海有限公司)]；LAL內(nèi)毒素定量檢測試劑盒(金斯瑞生物科技有限公司)；酶標儀(美國Biotek公司)等。

1.2實驗動物SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠40只，13～20 g；24只出生后19 d斷乳的Wistar雌鼠,均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗遵循國際通用的實驗用動物飼養(yǎng)管理和使用指南。

1.3rPAc疫苗和Re的制備rPAc疫苗制備和提取純化具體實驗步驟參考前期文獻[6-7]報道。用Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠從純化蛋白中去除殘留內(nèi)毒素，生理鹽水稀釋蛋白濃度為1 g/L，備用。人參皂苷Re用無菌生理鹽水配制成1 g/ L溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌備用。用LAL內(nèi)毒素定量檢測試劑盒檢測以上溶液內(nèi)毒素殘留量，用于免疫的rPAc和Re內(nèi)毒素水平<0.01 EU/μg。

1.4實驗分組及免疫方案8周齡BALB/c雌鼠40只隨機分為4組，每組10只。從每組動物中隨機選出5只，用于0～16周抗體動力學試驗。對每組動物中另外5只，在第10周，即末次免疫后8周處死，取脾，進行脾細胞刺激試驗。分組、免疫物及劑量如下：rPAc組(rPAc，50 μg/只)，rPAc+Re組(rPAc和Re，10 μg rPAc+40 μg Re/只)，Re組(Re，50 μg/只)，NS(生理鹽水，50 μg/只)。在未麻醉情況下經(jīng)鼻腔滴注，使小鼠以自由吸入方式攝取免疫物。2周后同樣劑量加強免疫1次。

1.5樣本收集和抗體檢測初次免疫前(0周)、初次免疫后2、4、6、8、10、12、16周收集血清和唾液樣本，處理后-70 ℃保存待測。10 μg/ml的純化抗原PAc標準品包被96孔酶標板，每孔100 μl，4 ℃過夜。洗滌，3%牛血清白蛋白封閉。將待測血清和唾液樣本分別按1 ∶100和1 ∶4稀釋，每孔加樣100 μl。另設標準曲線，5 μg/ml純化抗小鼠IgG或IgA包被，正常小鼠參考血清倍比稀釋，每孔加樣100 μl。待測血清中分別加入100 μl辣根酶標記的羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a(稀釋比例1 ∶4 000)，唾液樣本中加入羊抗小鼠IgA(稀釋比例1 ∶1 000)，37 ℃溫育2 h，加入OPD-枸櫞酸磷酸鹽緩沖液顯色，自動酶聯(lián)檢測儀測定 (490 nm)血清孔和唾液孔的吸光度值。根據(jù)四參數(shù)法通過標準曲線計算得出血清樣本中特異性抗體的含量，唾液樣本則計算抗PAc IgA抗體占唾液中總IgA的比值，以使得樣本中Ig的含量變化標準化[8]。

1.6脾淋巴細胞上清液細胞因子IFN-γ、IL-4檢測在小鼠末次免疫8周后處死，分離脾淋巴細胞。脾淋巴細胞分離后，制成單細胞懸液。調(diào)整脾細胞懸液濃度為2×106細胞/ml，每份標本設3孔，加至12孔板(1 ml/孔)，然后加入重組rPAc蛋白(2.5 μg/ml)，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，2 000 r/min離心20 min，收集上清液。以ELISA定量試劑盒分別檢測上清液中的IFN -γ和IL-4的水平，測定方法按試劑盒使用說明進行。

1.7大鼠齲齒保護效能實驗24只出生后19 d齡斷乳的Wistar雌鼠隨機分為4組，每組6只。斷乳后即給予致齲飼料2000#。20 d齡給予含氯霉素、氨芐青霉素和羧芐青霉素(用量為1 g/kg飼料)的致齲飼料，連續(xù)喂養(yǎng)3 d。24～26 d齡于牙面連續(xù)接種細菌濃度為1×109cfu/ml的變形鏈球菌Ingbritt。接種細菌前后以棉拭子采集口腔及磨牙牙合面的細菌標本，檢測口腔致齲菌感染的情況。第28天齡開始分組免疫，分組、免疫方案及免疫途徑同1.4 BALB/c雌鼠分組和免疫方案。鼠齡70 d時,處死大鼠，斷顱，分離上下頜骨，紫脲酸胺染色后，金剛砂片沿上、下頜磨牙牙合面近遠中向矢狀片切。根據(jù) Keyes經(jīng)典齲齒評分標準[9]在體式顯微鏡下分別記錄每只鼠釉質(zhì)齲 (enamel caries，E)、牙本質(zhì)淺齲 (dentin superficial caries，Ds)和牙本質(zhì)中齲 (dental middle caries，Dm)的情況并進行評分。

2 結果

2.1小鼠唾液特異性IgA和血清特異性IgG抗體水平Re+rPAc組在免疫后第2周唾液特異性抗PAc IgA和血清特異性抗PAc IgG均開始升高，在第8周達到最高水平(0.91±0.04vs11.41±1.16),第8周以后唾液特異性抗PAc IgA和IgG抗體水平都開始下降，但仍維持較高的抗體水平持續(xù)到第16周(0.79±0.043vs9.81±1.13)。同時Re+rPAc組在第4、6、8、10、12、16周的唾液特異性抗PAc IgA和血清特異性抗PAcIgG水平均顯著高于rPAc組(P<0.01)。rPAc組在第2周唾液特異性抗PAc IgA和血清特異性抗PAcIgG開始升高，第8周達到最高水平(0.52±0.05vs5.8±0.89)，第8周以后特異性IgA和IgG抗體水平都迅速下降。rPAc組免疫后第6、8、10、12周的唾液抗PAc IgA和IgG水平顯著高于Re組(P<0.05)及NS組(P<0.05)。Re組和NS組在各時間點均未檢測出特異性抗體。在其余檢測時間點上，各組間差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 免疫小鼠體內(nèi)特異性抗體水平

A：血清特異性抗PAc抗體水平；B：唾液特異性抗PAc IgA；與rPAc組比較:**P<0.01；與Re組比較：#P<0.05；與NS組比較：★P<0.05

2.2小鼠血清特異性IgG抗體亞型分析與Re組或NS組相比，rPAc組的IgG1明顯增高(P<0.05)，但IgG2a并無顯著變化(P>0.05)。與rPAc組、Re組和NS組相比，Re+rPAc組IgG1和IgG2a均明顯增高(F=8.95、6.15，P<0.05)。

rPAc組和Re+rPAc組免疫前(第0周)血清特異性IgG1/IgG2a比值較低，Re+rPAc組的血清特異性IgG1/IgG2a比值自免疫后第2周即迅速升高，在第4周時即達2.1，并一直維持在較高水平。Re+rPAc組在第2、4、6、8、10、12周的血清特異性IgG1/IgG2a比值(分別為1.9、2.1、3.7、4.2、4.6、3.9)均顯著高于rPAc組(分別為0.9、1.05、1.6、1.7、0.9、0.8)(P<0.05)。rPAc組血清特異性IgG1/IgG2a比值自第2周起逐漸升高，第8周后開始下降。rPAc組在第4、6、8周的血清特異性IgG1/IgG2a比值顯著高于Re組(P<0.05)和NS組(P<0.05)。Re促進機體Th2型免疫反應。見圖2。

圖2 免疫小鼠血清特異性抗PAc IgG亞型水平

A：血清特異性抗PAc IgG1和IgG2a抗體水平；B：免疫小鼠血清中IgG1/IgG2a的濃度比值；與rPAc組比較:*P<0.05；與Re組比較：#P<0.05；與NS組比較：★P<0.05

2.3小鼠脾細胞上清液中細胞因子的分泌水平經(jīng)PAc蛋白刺激48 h后，相對于Re組或NS組，Re+rPAc組提高了脾淋巴細胞上清液中IL-4和IFN-γ的濃度(P<0.05)，rPAc組僅提高了脾淋巴細胞上清液中IL-4的濃度(P<0.05)。Re+rPAc組的脾淋巴細胞上清液中細胞因子IFN-γ和IL-4的水平均顯著高于rPAc組(P<0.05)。以IL-4/IFN-γ比值進一步分析, Re+rPAc組為3.0，顯示Th2型細胞因子優(yōu)勢表達，而rPAc蛋白免疫組為1.2，Th2型優(yōu)勢效應不如Re+rPAc組。這與IgG亞型的分析結果一致。見圖3。

圖3 各組小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子IL-4和IFN-γ水平

A：IL-4；B：IFN-γ；與rPAc組比較:*P<0.05；與Re組比較：#P<0.05；與NS組比較：★P<0.05

2.4定菌鼠模型的檢測大鼠口腔廣譜抗生素滅菌后,BHI培養(yǎng)基上均可見大量乳白色圓形菌落,表面光滑,有濃厚的酵母氣味,為典型的酵母菌菌落(致齲飼料中含酵母粉)。MSB培養(yǎng)基上均無微生物生長?？谇唤臃N變形鏈球菌Ingbritt后,MSB培養(yǎng)基上均可見大量灰藍色菌落,表面粗糙,邊緣不整齊,高凸、嵌于瓊脂內(nèi),為典型的變形鏈球菌菌落。

2.5齲齒記分Re+rPAc組的E、Ds、Dm記分均顯著低于Re組(均P<0.05)和NS組(均P<0.05)，rPAc組的E、Ds、Dm記分均顯著低于Re組(P<0.05)和NS組(P<0.05)，進一步比較顯示Re+rPAc組的E、Ds和Ds記分最低，與rPAc比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時Re+rPAc組的總齲齒記分均數(shù)(E+Ds+Dm)為11.4±1.9，顯著低于rPAc組(30.4±4.8，P<0.05)、Re組(44.67±6.09，P<0.05)和NS組(45.8±3.8，P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠齲齒記分結果

1:NS組；2:Re組；3:rPAc組；4:Re+rPAc組；與rPAc組比較:*P<0.05；與Re組比較：#P<0.05；與NS組比較：★P<0.05

3 討論

來源于唾液的分泌型IgA(SIgA)和血清的IgG在維護口腔健康、抑制致齲性牙菌斑形成中均有重要作用[10]。SIgA廣泛分布于黏膜表面，占黏膜相關組織產(chǎn)生的所有抗體的80%，被認為是防齲的主要屏障。IgG是血清中免疫球蛋白的重要成分，通過齦溝上皮進入齦溝液成為唾液抗體的一部分，發(fā)揮抑菌作用。rPAc抑制齲病的主要機制在于誘導機體產(chǎn)生唾液特異性SIgA抗體?？筆Ac的SIgA抗體能夠與S.mutans結合，阻止其與牙面的非蔗糖依賴性黏附，并導致S.mutans最終被清除。本研究結果顯示,用Re作為rPAc佐劑可顯著提高小鼠血清特異性抗PAc IgG和唾液特異性抗PAc SIgA抗體水平，并且抗體水平持續(xù)至免疫后第16周抗體仍保持較高水平，誘導持久的免疫應答(圖1)。以往的研究[1,8]報道較大劑量的蛋白抗原(≥50 μg)才能激發(fā)機體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體達到防齲保護效果。在本研究中，僅用10 μg rPAc和Re佐劑聯(lián)合免疫就可誘導機體產(chǎn)生高水平的特異性抗體，這說明Re可以提高防齲疫苗rPAc的免疫效能。

rPAc和Re聯(lián)合免疫不僅有效地誘導了小鼠的黏膜和系統(tǒng)體液免疫反應，更為重要的是，對嚙齒類動物的齲齒的發(fā)生發(fā)展起到一定的預防作用。本研究顯示在定植了變異鏈球菌的大鼠中，rPAc和Re聯(lián)合免疫對變形鏈球菌的感染起到了明顯的抑制作用，rPAc+Re免疫組釉質(zhì)齲、牙本質(zhì)淺齲和牙本質(zhì)中齲均較rPAc免疫組、Re組或NS組顯著降低(圖4)。

為了明確rPAc和Re聯(lián)合免疫對免疫反應類型的影響，本實驗進一步檢測了血清特異性抗體亞型IgG1和IgG2a以及脾細胞上清液中細胞因子的濃度。IgG可以分為不同的亞類,如IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。當一個依賴T細胞的免疫發(fā)生的時候,針對某種抗原的特異性抗體的亞類組成就開始形成。而這些亞類的分布組成是誘導細胞和它分泌的細胞因子調(diào)節(jié)的。在小鼠體內(nèi),IL-4主要活化B細胞分泌IgG1分子(Th2型)；IFN-γ促進IgG2a和IgG3反應(Th1型)。研究[5]表明Re具有很強的佐劑活性,能增強抗原特異性誘導Th1和Th2型免疫應答，提高特異性抗體水平和細胞因子的表達水平。Sun et al[11]發(fā)現(xiàn)Rg1和Re能顯著提高小鼠抗OVA特異性IgG、IgG1、IgG2a的水平。Song et al[12]也發(fā)現(xiàn)Re與流感疫苗H3N2共同免疫小鼠能顯著提高小鼠的抗原特異性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平,IFN-γ和IL-5的表達水平。本研究也證實Re和rPAc聯(lián)合免疫明顯促進抗體亞類IgG1，IgG2a的產(chǎn)生以及脾淋巴細胞IL-4、IFN-γ表達(圖2、3)。同時IgG1/IgG2和IL-4/IFN-γ比值表明即使Re作為rPAc疫苗佐劑增強了Th1和Th2型免疫應答，但Re+rPAc組仍以Th2型免疫反應為主，這將有利于增強防齲效能，從而導致Re+rPAc組患齲率明顯下降(圖4)。原因在于細胞外病原的清除依賴機體產(chǎn)生的體液免疫反應,其主要體現(xiàn)在IgG1、IL-4的參與[13]。因此佐劑Re對調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生有利于保護效能的免疫反應類型是一個有效的途徑。決定原始細胞向Th1或Th2方向分化在很大程度上受到轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3基因的調(diào)控[14]。本研究中Re顯著增強了抗體亞類IgG1、IgG2a的產(chǎn)生，推測其機制或許和T-bet/GATA-3基因的表達上調(diào)有關,從而導致脾淋巴細胞IL-4和IFN-γ表達上升。其具體機制尚待進一步研究。

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