米 源，杜媛鯤，劉慶熠，廖海江，陳 閣，王 雷

食管癌是全世界最常見的惡性消化道腫瘤之一，在腫瘤相關(guān)的致死原因中排名第6位[1]。既往中晚期食管癌的治療策略以手術(shù)為主，放化療為輔，但多年來五年生存率并沒有顯著改善，提示進(jìn)一步了解食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為對于腫瘤治療至關(guān)重要。Hedgehog信號通路是近年來研究熱點之一，在非小細(xì)胞肺癌[2]、胰腺癌[3]、基底細(xì)胞癌[4]和肝癌[5]等多種實體腫瘤中異常活化，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，其中Gli作為Hedgehog通路下游的核心組分在信號傳導(dǎo)中發(fā)揮核心調(diào)控作用，但其調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明。

近年來研究[6-7]顯示Hedgehog信號通路與PI3K/AKT信號通路之間存在著密切聯(lián)系，通過交叉調(diào)控現(xiàn)象促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，然而，在食管鱗癌組織中Hedgehog 信號通路是否通過 PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用以及如何影響該信號通路尚缺乏直接證據(jù)，闡明上述作用關(guān)系對于明確Hedgehog 信號通路調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制至關(guān)重要，因此該研究通過分析人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-30細(xì)胞中的Gli和PI3K/AKT通路的關(guān)系進(jìn)一步研究腫瘤的進(jìn)展，為腫瘤的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-30 購自英國Sigma-Aldrich公司，青-鏈霉素購自上海書吉生物有限公司，Taqman 基因表達(dá)預(yù)混液(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin、GAPDH引物及探針均購于美國生命技術(shù)公司，Pierce-BCA 蛋白分析試劑盒(美國賽默飛公司)，ECL試劑(賽默飛世爾科技公司)，Gli1、Vimentin單克隆抗體(美國Abcam公司)，GAPDH、AKT和p-AKT單克隆抗體(美國Cell signaling公司)，Gli2、N-cadherin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，GANT61(美國Selleckchem公司)，結(jié)晶紫購自美國Sigma公司，N-Shh蛋白(美國EBioscience公司)，RPMI1640和 Ham細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，總RNA提取試劑盒(德國 Qiagen公司)，matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)。

1.1.2主要儀器 ABI Prism 7900HT型熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Veriti? 96-Well Thermal Cycler購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，ELX800多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，小型 Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(美國伯樂公司)，NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(美國賽默飛公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中KYSE-30細(xì)胞用含2%胎牛血清，青-鏈霉素各100 mg/ml， RPMI 1640 和Ham細(xì)胞培養(yǎng)液(1 ∶1)培養(yǎng)。

1.2.2實時熒光定量PCR法 將培養(yǎng)的生長狀態(tài)良好的KYSE-30細(xì)胞用0.25%胰酶消化后離心并細(xì)胞計數(shù)后鋪于12孔板，等第2天細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%時更換無血清培養(yǎng)基。設(shè)DMSO對照組、GANT61組(10 μmol /L)、N-Shh蛋白組(0.5 mg/ml)以及GANT61&N-Shh組(10 μmol /L GANT61處理細(xì)胞30 min后0.5 mg/ml N-Shh 處理細(xì)胞24 h)。然后按照總RNA說明書提取RNA并上機(jī)進(jìn)行檢測，在25 ℃5 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的反轉(zhuǎn)錄條件下進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，然后用無R-Nase水稀釋10倍后于每孔加cDNA 4.5 μl、Gli1引物及探針0.5 μl、Gli2引物及探針0.5 μl、Vimentin引物及探針0.5 μl、N-cadherin引物及探針0.5 μl和GAPDH引物及探針0.5 μl、Taqman 基因表達(dá)預(yù)混液5 μl，10 μl/孔，加樣在384孔板上并放到ABI 7900HT PCR儀中進(jìn)行PCR檢測， 40個循環(huán)并用2-△Ct法進(jìn)行分析。

1.2.3Western blot法 將處理好的食管鱗癌細(xì)胞KYSE-30設(shè)DMSO組、GANT61組(10 μmol/L)、N-Shh蛋白組(0.5 mg/ml)以及GANT61&N-Shh組(10 μmol /L GANT61處理30 min后0.5 mg/ml N-Shh 處理細(xì)胞)。24 h后收集每組樣本總蛋白提取液并用BCA法測定樣本總蛋白濃度。以每孔10 μg蛋白上樣，在200 V、40 min的反應(yīng)條件下經(jīng)Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進(jìn)行電泳。在100 V、40 min條件下移到PVDF膜并封膜1 h。加入一抗Gli1、Gli2、Vimentin、N-Cadherin、AKT、p-AKT、GAPDH并在 4 ℃環(huán)境下過夜。第2天收集一抗后加二抗羊抗兔或羊抗鼠(工作濃度均為1 ∶10 000)室溫孵育1 h。收集二抗用TBST洗膜，加ECL試劑顯色并在X線下曝光顯影，實驗重復(fù)3次。

1.2.3Transwell侵襲實驗 將matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃融化，然后用培養(yǎng)基稀釋放置于培養(yǎng)箱中待固化。實驗分為4組：DMSO組、GANT61組、N-Shh組、GANT61&N-Shh組。收集處理后的KYSE-30吹打為單細(xì)胞懸液重懸并以7.5×104個細(xì)胞100 μl加到上室，下室加入500 μl 10%血清的培養(yǎng)液，注意防止大氣泡的產(chǎn)生，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞固定、染色后在高倍鏡視野(×400)隨機(jī)選取4個視野，取平均值。重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理使用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用方差分析，組間比較采用LSD方法。

2 結(jié)果

2.1各組實時熒光定量PCR檢測結(jié)果PCR結(jié)果顯示：Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin mRNA表達(dá)各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=293.12，P<0.001；F=613.55，P<0.001；F=549.36，P<0.001；F=1 527.72，P<0.001)。其中GANT61作用于KYSE-30細(xì)胞24 h后導(dǎo)致Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin mRNA的表達(dá)水平低于DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；同樣N-Shh組可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；同樣，GANT61&N-Shh組可以部分上調(diào)腫瘤細(xì)胞Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。GANT61&N-Shh組與GANT61組相比，Gli1、Gli2、Vimentin和 N-cadherin的mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。

圖1 各組實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

與DMSO組比較：*P<0.001；與GANT61組比較：#P<0.001

2.2各組Westernblot結(jié)果Western blot 結(jié)果表明：Gli1蛋白、Gli2蛋白、p-AKT蛋白、Vimentin蛋白、N-cadherin蛋白表達(dá)各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=786.828，P<0.001；F=1 113.27，P<0.001；F=2 206.05，P<0.001；F=529.04，P<0.001；F=1 416.46，P<0.001)；AKT各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.45，P=0.072)。其中經(jīng)GANT61處理KYSE-30細(xì)胞24 h后Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)均顯著低于DMSO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；同樣，N-Shh處理組Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；GANT61&N-Shh組與DMSO對照組相比可以部分上調(diào)Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。GANT61&N-Shh組與GANT61組相比，Gli1、Gli2、p-AKT、Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)均高于GANT61組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。

圖2 Western blot法檢測食管鱗癌KYSE-30中蛋白表達(dá)

A：KYSE-30中的蛋白表達(dá)；B：柱狀圖；a：DMSO組;b：N-Shh組；c：GANT61組；d：GANT61&N-Shh組；與DMSO組比較：*P<0.001；與GANT61組比較：#P<0.001

2.3Transwell侵襲實驗結(jié)果各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=519.11，P<0.001)：與DMSO對照組比較，GANT61組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(P=0.000)，N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.001)，GANT61&N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.001)，GANT61&N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)較GANT61組穿膜細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。

圖3 Transwell侵襲實驗檢測各組KYSE-30細(xì)胞侵襲能力

a：DMSO組;b：N-Shh組；c：GANT61組；d：GANT61&N-Shh組；與DMSO組比較：*P<0.001；與GANT61組比較：#P<0.001

3 討論

經(jīng)典的Hedgehog通路是過度表達(dá)的Shh結(jié)合跨膜受體Ptch，此過程解除了Ptch對Smo的抑制作用，接下來活化的Smo將信號傳遞到核轉(zhuǎn)錄因子Gli，活化的Gli1和Gli2促進(jìn)Hedgehog通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，其通路的過度激活可引起細(xì)胞過度增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，在前列腺癌中Tong et al[8]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在抑制腫瘤進(jìn)展過程中抑制Gli家族轉(zhuǎn)錄因子比抑制Smo更有效。同時Gli在Hedgehog信號通路中發(fā)揮了承上啟下的核心作用，因此針對Gli為靶點的治療可以對Hedgehog通路進(jìn)行精確的調(diào)控[9-10]并能更高效更精準(zhǔn)地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而為食管鱗癌的靶向治療提供新的方向。PI3K / AKT / mTOR是研究最多的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑之一，并有研究[11]顯示在卵巢癌等多種腫瘤中其通路存在異常表達(dá)，而磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidvlinositol-3-kinases,PI3K)與其下游絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt相互作用是細(xì)胞內(nèi)重要的信號通路之一，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等多種過程[12-14]。而腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程同樣受到多種信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認(rèn)為是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移最初及重要的一步，其表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性及與基底膜連接等上皮表型的缺失和較高的遷移與侵襲的間質(zhì)表型的增加。N-鈣粘蛋白(N-cadherin)位于人體18染色體上，N-cadherin作為EMT的重要標(biāo)記之一，在許多腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，在腫瘤的發(fā)展過程中N-cadherin功能缺失及N-cadherin功能的獲得被認(rèn)為是EMT的普遍現(xiàn)象，也可作為判斷預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[15-16]，Da et al[17]研究發(fā)現(xiàn)N-cadherin通過調(diào)節(jié)相應(yīng)信號通路及EMT過程促進(jìn)甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展，同時其可能作為甲狀腺癌治療的潛在靶點。波性蛋白(Vimentin)是一種57 ku的III型中間絲蛋白，在小鼠胚胎發(fā)育中被發(fā)現(xiàn)在前體神經(jīng)和間充質(zhì)細(xì)胞中，由組織特異性中間絲蛋白逐漸轉(zhuǎn)變形成。波形蛋白是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的預(yù)測性生物標(biāo)志物之一[18]，與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[19]。Li et al[20]研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中Gli高表達(dá)時E-鈣粘蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)并且腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力增加，說明Gli可能通過作用EMT過程影響肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，同時在體外實驗中Gli抑制劑阻止了細(xì)胞遷移和侵襲并減少腫瘤生長并增加體內(nèi)E-鈣粘蛋白表達(dá)，顯示了作為治療肺腺癌靶向藥物的前景。但在食管鱗癌中Gli是否通過調(diào)控PI3K/AKT通路影響EMT過程而增加細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力至今未有明確報道。

本研究為了闡明Gli、PI3K/AKT與EMT的關(guān)系，通過應(yīng)用特異性Gli1和Gli2靶點的小分子抑制劑GANT61和Shh通路蛋白激活劑N-Shh來觀察Gli再被抑制及活化后Vimentin和N-cadherin表達(dá)的變化來說明它們之前是否存在聯(lián)系。結(jié)果顯示GANT61組明顯下調(diào)了KYSE-30 細(xì)胞的Gli1、Gli2、Vimentin和N-cadherin基因表達(dá)以及相應(yīng)蛋白及p-AKT蛋白的表達(dá)，AKT蛋白表達(dá)并沒有明顯變化；而應(yīng)用N-Shh激活通路后可以明顯上調(diào)了食管鱗癌細(xì)胞KYSE-30相應(yīng)基因及蛋白的表達(dá)，同樣AKT蛋白表達(dá)并無明顯變化。最后再使用GANT61后再用N-Shh激活Hedgehog/ Gli通路，結(jié)果顯示Gli1、Gli2、Vimentin、N-cadherin基因表達(dá)得到部分恢復(fù)，同樣p-AKT及相應(yīng)蛋白表達(dá)也得到了部分恢復(fù)，表明Shh/Gli通路與PI3K /AKT通路之間存在串聯(lián)關(guān)系。Transwell實驗也進(jìn)一步說明Hedgehog/ Gli表達(dá)與食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，分析其中的原因可能是在食管鱗癌細(xì)胞中Gli通過活化PI3K /AKT信號通路上調(diào)了Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了EMT進(jìn)程，增加了食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而這與Williamson et al[21]和Sun et al[22]分別在研究甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路通過激活A(yù)kt和c-Met通路促進(jìn)EMT進(jìn)程和在研究肝癌中通過激活抑癌基因SASH1下調(diào)了Shh-Gli1和PI3K-AKT通路進(jìn)而抑制了肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的結(jié)果是相符的。

總而言之，腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程與多種細(xì)胞因子及通路密切相關(guān)，本研究目的是初步闡述了在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中， Hedgehog/Gli通路的異?；罨赡芡ㄟ^調(diào)控PI3K/AKT通路來促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而增加食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，靶向抑制Gli1和Gli2為食管鱗癌的治療開辟了新的方向。

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