劉麗麗 李建輝 鄭雪良 陳駿 楊海英 劉春榮

（浙江省衢州市農業(yè)科學研究院衢州324000）

黑桃是原產于我國浙西山區(qū)的一個稀有地方特色桃品種，又名烏桃，屬南方品種群硬肉桃亞群[1，2]。黑桃果實皮紫肉紅，汁液豐富，酸甜適中，口感爽脆獨特，具有濃郁的蜂蜜風味及較高的藥用和保健價值，是目前非常稀少的集食用和保健于一體的珍貴水果。因此，隨著人們營養(yǎng)和保健意識的增強，黑桃必將日益受到消費者的親睞，發(fā)展前景十分廣闊。

近年來，隨著分子生物學研究的不斷深入和實踐應用的快速發(fā)展，DNA分子標記技術在桃研究中的應用越趨廣泛[3，4]。微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR），是一類由幾個核苷酸（ 1～6bp）組成的串聯(lián)重復DNA序列，廣泛分布于各類真核生物和部分原核生物基因組中，由于重復基元和次數(shù)不同從而形成了等位基因之間的多態(tài)性[5～7]。相比較其他分子標記而言，微衛(wèi)星標記具有較高的多態(tài)性和較好的重復性，同時還具有進化所受選擇壓力小、共顯性遺傳、易于分析等特點[8，9]，現(xiàn)已廣泛應用于分子生物學、遺傳學、育種學等領域[10～12]。

為此，本文利用IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM高通量測序平臺對黑桃轉錄組進行雙向測序，并對其微衛(wèi)星序列特征進行分析，以期為后續(xù)開展黑桃種質資源創(chuàng)新和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016年 9月在衢州市農業(yè)科學研究院果樹研究所試驗基地采集黑桃健康幼嫩葉片，擦拭干凈后用液氮迅速冷凍，再裝入放有足量干冰的低溫貯藏箱中送至上海翰宇生物科技有限公司利用IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM高通量測序平臺進行轉錄組雙向測序。

1.2 分析方法

從黑桃葉片中提取總RNA，使用2100Bioanalyzer對總RNA進行質檢，并對合格RNA樣本利用DNaseI（Takara，日本）在37℃消化30min。DNase消化后的RNA利用Dynabeads?Oligo(dT)25（Life，美國）進行mRNA純化。將得到的RNA補足至100μl的體積，加100μl Binding Buffer，65℃加熱2min，立即置冰上冷卻，加入100μl預洗滌過的磁珠，室溫下充分混勻5min，置磁力架（Life，美國）上1～2 m i n，將上清吸取干凈，加200μl Washing Buffer B洗滌兩次后，加15μl預冷的10 mM Tris-HCl重懸磁珠，75℃～80℃加熱2min，立即置磁力架上1～2min，小心吸取上清，即為純化得到的mRNA。取100ng 純化的mRNA，用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國）構建文庫。文庫構建完成后，經Qubit 定量、2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、High-sensitivity DNA chip檢測，確保文庫質量。取10ng 的文庫，用TruSeq PE Cluster Kit（illumina，美國）在cBot中進行cluster generation，然后在IlluminaHiseqTM2500/MiSeqTM中進行雙向測序。高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉化為原始測序序列（Sequenced Reads），結果以FASTQ文件格式存儲。同時，為了保證信息分析質量，再對原始數(shù)據(jù)過濾，得到Clean數(shù)據(jù)，后續(xù)分析都基于Clean數(shù)據(jù)，使用Trimmomaticv0.32[13]進行數(shù)據(jù)處理。隨后，使用Fastqc v0.10.0[[14]對樣品的測序數(shù)據(jù)質量進行可視化評估。最后對黑桃轉錄組測序結果采用MIcroSAt，使用Trinityv2.06[15]將clean數(shù)據(jù)denovo組裝成轉錄本。

對黑桃轉錄組測序結果采用MIcroSAt -ellite（MISA）軟件（http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/）搜索SSR重復序列，設定單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重復分別為12、6、4、4、3和3次。復合SSR 兩個位點間最大間隔堿基數(shù)為100。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序組裝結果及統(tǒng)計

對黑桃轉錄組測序共得到30536554個cleanreads，總數(shù)據(jù)量9.16 G。將clean數(shù)據(jù)denovo組裝成轉錄本，再對轉錄本去冗余，取每個轉錄本聚類中最長的作為Unigene，以此作為后續(xù)分析的參考序列。轉錄本及Unigene統(tǒng)計結果如表1所示，從中可以看出，黑桃轉錄組測序結果共組裝得到79161個轉錄本，去冗余后得到39120個Unigene，長度介于224～16849，平均長度為1019.17。

2.2 不同重復基元微衛(wèi)星的類型

表1 黑桃轉錄組測序組裝結果統(tǒng)計

采用MISA軟件共搜索到11182個SSR，可分為7種類型：復雜重復、單堿基重復、二堿基重復、三堿基重復、四堿基重復、五堿基重復、六堿基重復，數(shù)量分別為978個、4492個、3927個、1597個、127個、33個、28個，表明黑桃轉錄組中SSR重復基元類型的數(shù)量主要以單堿基重復、二堿基重復以及三堿基重復為主，其他類型的數(shù)量相對較少。

2.3 不同重復基元微衛(wèi)星的頻率

從黑桃轉錄組序列中單堿基基元重復次數(shù)總體分布情況來看（表2），單堿基微衛(wèi)星重復以(A)n和(T)n為主，數(shù)量分別為2179個、2287個，其中(T)n微衛(wèi)星重復的數(shù)量略多于(A)n。此外，單堿基重復次數(shù)主要集中在10個至14個，堿基重復數(shù)在15個以上的相對較少。黑桃轉錄組序列中二堿基重復有(AC)n、(AG)n、(AT)n、(CA)n、(CT)n、(GA)n、(GT)n、(TA)n、(TC)n、(TG)n，數(shù)量分別為 73、862、384、62、664、782、44、272、684、100，其中以(TC)n最多，(AG)n次之，(GT)n最少。黑桃轉錄組序列中三堿基重復以(GAA)n、(TTC)n、(AAG)n數(shù)量相對較多。

表2 黑桃轉錄組序列中SSR單堿基基元重復次數(shù)的分布

2.4 微衛(wèi)星的長度分布

黑桃轉錄組序列中所發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星長度存在較大的差異，從10～213個堿基不等，平均長度為22.5個堿基?？傮w而言，黑桃轉錄組序列中的微衛(wèi)星以重復長度小于或等于20bp的短重復序列最多，占微衛(wèi)星總數(shù)的65.65%，而長度大于20bp的長序列重復僅占微衛(wèi)星總數(shù)的34.35%。

3 討論

微衛(wèi)星標記具有較強的物種保守性和專一性，不同物種微衛(wèi)星側翼序列有所不同，從而限制了微衛(wèi)星引物的通用性，因此要對一個物種進行微衛(wèi)星分析，通常需要預先開發(fā)這個物種的微衛(wèi)星標記[16]。目前，開發(fā)微衛(wèi)星標記的方法較多，但普遍存在步驟繁瑣、效率低、耗時長等問題。近年來，對轉錄組進行高通量測序已成為一種高效、快捷的獲得基因序列的研究手段，基于該技術進行微衛(wèi)星標記開發(fā)具有信息量大和通用性好的特點，現(xiàn)已廣泛應用于不同物種的微衛(wèi)星引物開發(fā)[17，18]。

另一方面，微衛(wèi)星序列對基因的功能會產生重要影響，其序列特征是了解不同物種基因組差異的重要指標[19]。從本研究結果來看，黑桃轉錄組共有11182個SSR，可分為7種類型：復雜重復、單堿基重復、二堿基重復、三堿基重復、四堿基重復、五堿基重復、六堿基重復，其中單堿基重復、二堿基重復以及三堿基重復占多數(shù)，其他類型的數(shù)量相對較少。黑桃轉錄組序列中單堿基微衛(wèi)星重復以(A)n和(T)n為主，二堿基重復以(TC)n、(AG)n數(shù)量較多，三堿基重復以(GAA)n、(TTC)n、(AAG)n數(shù)量較多。黑桃轉錄組微衛(wèi)星呈現(xiàn)出單堿基重復較多且單堿基重復主要以(A)n和(T)n為主的分布特征，表明單堿基在整個黑桃轉錄組中變異最為活躍，這在其他植物中也有類似的報道[20，21]。此外，黑桃轉錄組序列中微衛(wèi)星長度介于10～213個堿基，其中以重復長度小于或等于20 bp的短重復序列最多，這與碧桃（Prunus persicacv.duplex）的研究結果基本一致[19]。

對黑桃進行微衛(wèi)星標記開發(fā)，不僅可用于其種質資源創(chuàng)新和利用，而且可為桃屬其他植物提供重要分子工具，因而具有廣泛的應用前景。本研究對黑桃轉錄組微衛(wèi)星特征的分析可為后續(xù)開發(fā)微衛(wèi)星標記提供重要參考。從研究結果來看，在開發(fā)黑桃微衛(wèi)星標記過程中，推薦開發(fā)(A)n和(T)n為主的單堿基微衛(wèi)星、(TC)n或(AG)n為主的二堿基微衛(wèi)星以及(GAA)n或(TTC)n或(AAG)n為主的三堿基微衛(wèi)星，這些微衛(wèi)星在黑桃基因組中出現(xiàn)的頻率較高，有助于提高引物開發(fā)效率。

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