田 瑞，劉玄福，張東林，辛樹陽，霍少飛，楊彩然，劉謝榮，芮 萍，馬增軍

(河北科技師范學院，河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室,河北秦皇島 066600)

大腸埃希菌是一類可引起人和動物共感染的人畜共患病病原。常引起仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病。腸外致病性大腸埃希菌也可致動物腸外組織感染，使不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染，已引起廣泛關注。多年來，畜禽生產依賴于抗生素的使用來克服細菌病壓力。越來越多的證據表明，抗生素耐藥性已是普遍存在的問題。2015年中國科學院廣州地球化學研究所研究結果顯示，2013年中國抗生素總使用量約為16.2萬t，其中48%為人用抗生素，其余為獸用抗生素。另有媒體報道，我國抗生素的使用量約占世界總使用量的50%(http://c.cnhubei.com/zxzp/201506/t327035.shtml)。英國經濟學者吉姆·奧尼爾發(fā)布了全球首份《反抗生素濫用報告》，報告顯示，全球因為濫用抗生素，每年造成數百萬人因為細菌抗藥性而離世。如果不采取切實行動，到2050 年，每年全球因抗生素濫用而造成死亡的人數將超過1 000萬，包括100萬中國人(http:// news.youth.cn/jk /201506/t20150617-6763221.htm)。由于養(yǎng)豬生產中抗生素使用不規(guī)范及濫用，導致大腸埃希菌的多重耐藥譜越來越寬、耐藥水平不斷升高，抗生素的有效性也大幅度的降低。為了解河北省規(guī)模豬場大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥情況，本研究對河北省9個地區(qū)分離獲得的豬源大腸埃希菌進行耐藥性測定，為有效防控大腸桿菌病，科學使用藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從河北省9個代表地區(qū)的規(guī)模養(yǎng)豬場(秦皇島、唐山、滄州、衡水、保定、張家口、承德、邯鄲、廊坊)，采集腸拭子所分離獲得的240株大腸埃希菌。大腸埃希菌AYCC25922為標準質控菌株，引自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑和藥物 試驗所用培養(yǎng)基及生化鑒定試劑均為北京陸橋北京陸橋技術有限公司產品；氨芐西林(AM)、阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(EFT)、丁胺卡那霉素(AMK)、大觀霉素(SPT)、多西環(huán)素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、恩諾沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、乙酰甲喹(MQD)、黏菌素(COL)等藥物為河北遠征生物工程有限公司產品；美羅培南(MEM)購于上海宸功生物技術有限公司；以上13種藥物的配制參照CLSI(2016)標準。

1.2 方法

1.2.1 MIC值測定 嚴格按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI,2014)推薦的藥敏試驗操作方法和標準，進行微量稀釋法的藥敏試驗及結果判斷[1]。每種菌增菌至108cfu/mL，然后稀釋為(105～106)cfu/mL，接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37℃水浴培養(yǎng)24 h，觀察結果。檢測結果判定按NCCLS標準執(zhí)行，只有當陽性對照孔(不含抗生素)孔內細菌有明顯生長，加樣孔透明或孔底的沉淀不大于2 mm稀釋度孔，才是該藥的MIC。NCCLS中沒有的按該菌株的群體分布情況判斷。對所測得的MIC結果經統計學處理，得出MIC50、MIC90及MIC范圍，并計算細菌對各抗菌藥的耐藥率(包括中介菌株)。

2 結果

2.1 各地區(qū)分離菌株

各地區(qū)分離菌株數量見表1。

表1 各地區(qū)大腸埃希菌分離數量

2.2 240株大腸埃希菌對常用藥物的耐藥性

通過微量稀釋法測定河北部分地區(qū)9個規(guī)模化豬場豬大腸埃希菌對常用藥物的最低抑菌濃度值(MIC)，并根據CLSI(2016)標準對所檢測的數據進行判定其耐藥R、中介I或敏感S，計算13種藥物的耐藥率(表2)。多數菌株對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星耐藥，耐藥率分別為99.58%、98.33%、90.08%、78.75%、98.33%；對美羅培南的耐藥率為15.83%；240株菌對大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺六甲氧嘧啶、恩諾沙星、乙酰甲喹、黏菌素全部耐藥。

2.3 不同地區(qū)菌株對13種藥物的耐藥性

河北省9個地區(qū)豬源大腸埃希菌對13種藥物的耐藥率(包括中介)分析顯示，各地區(qū)對大觀霉素(SPT)、多西環(huán)素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、恩諾沙星(ENR)、乙酰甲喹(MQD)及黏菌素(COL)藥物的耐藥率100%；對氨芐西林(AM)耐藥率高達99%～100%，阿莫西林/克拉維酸(A/C)耐藥率達89%～100%，左氧氟沙星(LEV)耐藥率約在89.3%～100%，衡水、承德地區(qū)對頭孢噻呋(EFT)和丁胺卡那霉素(AMK)的耐藥率較低，其他地區(qū)耐藥性仍高達71.4%以上。僅美羅培南(MEM)對分離菌株的耐藥率較低，然而邯鄲地區(qū)分離菌株對美羅培南(MEM)的耐藥率高達64.3%(表3)。

表2 13種常用抗菌藥物對分離大腸埃希菌的耐藥率

2.4 240株豬源大腸埃希菌對13種常用抗菌藥物耐藥譜分析

所測得的240株大腸埃希菌中，15.83%(38/240)的菌株對13種抗菌藥物全耐藥，耐12種抗菌藥物的菌株最多，占60.83%(146/240)，耐11種抗菌藥物的菌株占15.42%(37/240)，耐10種抗菌藥物的菌株相對較少占8%(19/240)。240株菌對13種抗菌藥物形成8種耐藥譜型，其中以12種耐藥譜型氨芐西林-阿莫西林/克拉維酸-頭孢噻呋-丁胺卡那霉素-大觀霉素-多西環(huán)素-氟苯尼考-磺胺六甲氧嘧啶-恩諾沙星-氧氟沙星-乙酰甲喹-黏菌素為主，約占所有耐藥菌譜型的59.58%(143/240)。其次為11種耐藥譜型氨芐西林-阿莫西林/克拉維酸-頭孢噻呋-大觀霉素-多西環(huán)素-氟苯尼考-磺胺六甲氧嘧啶-恩諾沙星-氧氟沙星-乙酰甲喹-黏菌素，約占13.33%(32/240)(表4)。

表3 各地區(qū)豬源大腸埃希菌對13種藥物的耐藥率(%)

表4 河北省240株豬源大腸埃希菌的耐藥譜

3 討論

由于豬場飼養(yǎng)管理不夠規(guī)范，以及豬藍耳病、圓環(huán)病毒病、豬流行性腹瀉等病毒病廣泛發(fā)生，常常繼發(fā)或并發(fā)大腸桿菌病，為減少經濟損失，豬場頻繁使用抗生素加強治療及預防，導致豬場對常用抗生素的耐藥性逐年增加。藥敏試驗顯示，臨床中分離的240株豬源大腸埃希菌大都呈多重耐藥，尤其對大觀霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺六甲氧嘧啶、恩諾沙星、乙酰甲喹、黏菌素全部耐藥；多數地區(qū)分離菌株對頭孢噻呋鈉、丁胺卡那霉素100%耐藥，只有少數地區(qū)分離株對這兩種藥物的耐藥性低于50%；僅有美羅培南保持良好的敏感性。這些數據表明，本次分離的豬源大腸埃希菌的耐藥性顯著高于文獻[2-4]中分離的大腸埃希菌，這與我國在豬病防治中頻繁使用以上抗生素密切的聯系。畜禽攜帶的大腸埃希菌在全球范圍內都有很強的耐藥性，尤其是養(yǎng)殖業(yè)中常用的一些抗生素，對某些抗生素耐藥率達到100%，并且出現了大量多重耐藥菌株，部分多重耐藥株可耐12種抗生素[5]。鄭重提示嚴禁在飼料中添加抗菌藥物，取而代之的有益生素、微生態(tài)制劑、中藥制劑等。對細菌感染發(fā)病動物的治療，必須通過藥敏試驗選擇敏感藥物，既可以提高療效，又可以避免濫用藥物帶來的不良反應和耐藥性。

硫酸多黏菌素被喻為“抗生素最后一道防線”，是治療革蘭陰性菌引起腸道感染的首選藥，2002年肖希龍等[6]報道，硫酸多黏菌素顆粒劑能有效地控制乳豬大腸埃希菌引起的下痢，降低大腸埃希菌感染乳豬的病死率，用于預防和治療乳豬大腸埃希菌感染。但是，黏菌素作為抗菌促生長劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大量廣泛使用，導致廣泛產生耐藥性[7]，本試驗測得結果顯示黏菌素的耐藥性為100%。為保障動物產品質量安全和公共衛(wèi)生安全，自2016年11月1日起，中華人民共和國農業(yè)部公告第2428號，停止硫酸多黏菌素用于動物促生長。

碳青霉烯類抗生素是臨床治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的最重要抗菌藥物，沈建忠等[8]報道在商品雞場的雞、鳥、犬等動物體內分離到攜帶blaNDM基因的大腸埃希菌，與澳大利亞、美國、等國家臨床分離的blaNDM耐藥大腸埃希菌親緣關系相近。本試驗測得河北省9個地區(qū)240株豬源大腸埃希菌對美羅培南的耐藥率為15.83%，部分地區(qū)達到64.3%。這些數據提示相關部門應加強相關的監(jiān)測制度，養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)人員要規(guī)范使用抗菌藥物，以保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

參考文獻：

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[4] 矯薇薇,徐國鋒,王宏棟,等.江西地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥性試驗[J].中國獸醫(yī)雜志,2015,51(10):77-79.

[5] 高海濤,韓俊麗,關道明.大腸桿菌耐藥現狀的嚴峻性[J].生命科學,2017，29(5)：514-520.

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[7] 易靈嫻,劉藝云,劉健華,等.質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1研究進展[J].遺傳,2017,39(2):110-126.

[8] Shen J.Wang Y,Zhang R,et al.Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and MCR-1 in Chinese poultry production[J].Nat Microbiol，2017,25(6):24.