張尚衛(wèi)，黃大鵬

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319)

胎盤肽(placental polypeptide，PP)又稱胎盤免疫調節(jié)肽、胎盤轉移因子，是從動物胎盤中分離提純得到的由核苷酸、肽類、和各種氨基酸等小分子物質混合而成的多肽。研究發(fā)現(xiàn)[1]胎盤肽具有抗菌抗氧化、提高機體免疫力等多種生物活性功能，它不僅能夠促進T淋巴細胞E受體表達，還能促進淋巴細胞有絲分裂，從而增強細胞免疫。采用超聲波破碎[2]、酶解[3]、組織勻漿[4]等方法，均能從鮮活胎盤中釋放并提取出胎盤肽，胎盤組織中細胞壁的破碎以及固液分離程度對胎盤肽的提取效率有較大影響，不同的提取工藝對不同動物胎盤中胎盤肽的提取效率也不盡相同。目前我國基礎母豬存欄大約3 500萬頭，每年可產(chǎn)出大量豬胎盤。研究豬胎盤內含有的活性物質，對合理利用數(shù)量龐大的豬胎盤資源具有重要意義。本試驗用組織勻漿法提取豬胎盤肽，采用Tricine-SDS-PAGE 電泳法和考馬斯亮藍 G-250法對豬胎盤肽分子量大小和含量進行測定，為豬胎盤的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鮮活胎盤由大慶市龍鳳區(qū)某養(yǎng)殖場提供；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品；溴芬蘭、巰基乙醇均為北京科昊達生物技術公司產(chǎn)品 ；冰醋酸、尿素、甘油為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；三羥甲基氨基甘氨酸(ttricine)、十二烷基磺酸鈉(SDS)為Biomo公司產(chǎn)品；Tris堿、TEMED為上海化學試劑公司產(chǎn)品 ；過硫酸銨(AP)為BIB產(chǎn)品 ；超低分子蛋白marker為北京索萊寶公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白均為北京Solarbio公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 豬胎盤肽的提取 選取6付剛娩出鮮活豬胎盤，將其分為A、B、C、D、E、F 6個組，從每付胎盤中3個隨機部位各剪取1 g胎盤組織，并分別標記為A1、A2、A3；B1、B2、B3……F1、F2、F3，將胎盤組織用鹽水沖洗干凈后用吸水紙把水分吸凈，加入1.5倍去離子蒸餾水，置于高速組織搗碎勻漿機(12 000 r/min，3 min/次，10次)勻漿，經(jīng)3次反復凍融后于高速冷凍離心機冷凍離心(8 000 r/min，20 min)，取上清液用0.45 μm微孔濾器進行微濾處理，以除去不溶性雜質，將提取液進行分裝，置-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Tricine-SDS-PAGE 電泳法檢測豬胎盤肽分子量

1.2.2.1 試劑的配置與灌膠 電泳液的配置與灌膠參照周國華[5]改良后的 Tricine-SDS-PAGE電泳法進行，凝膠由3層不同密度膠體構成，分別為分離膠、間隙膠和濃縮膠。

1.2.2.2 上樣與電泳 電泳儀和電泳槽安裝完畢后，加入電泳液，下槽裝陽極緩沖液，上槽裝陰極緩沖液。將待測液和上樣緩沖液以1∶1混合均勻后，沸水浴加熱5 min后冷卻，開始上樣。取20 μL蛋白質標準品加入第1個點樣孔，另外分別從每組樣品液中取20 μL依次加入點樣孔內。先將電壓調至30V約1.5 h，待樣品進入分離膠后電壓升至120V至電泳結束。

1.2.2.3 染色和脫色 電泳結束后將膠至于染色液中緩慢振蕩染色20 min，之后轉移至脫色液中進行脫色，脫色至條帶清晰后進行照膠分析。

1.2.3 考馬斯亮藍G-250法測定胎盤肽的含量

1.2.3.1 試劑的配置 考馬斯亮藍G-250溶液與標準蛋白質溶液均按常規(guī)方法進行配置與保存[6]。

1.2.3.2 制作標準曲線 取6支10 mL具塞試管分別編號0、1、2、3、4、5號，并按表1中所示分別加入相應試劑，充分混勻2 min后在595 nm波長下測定其吸光度值(OD)，然后繪制標準曲線并求出標準方程。

表1 標準曲線制作表

1.2.3.3 待測液的測定 吸取0.01 mL樣品溶液，用蒸餾水補至0.1 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍G-250顯色劑，充分混勻2 min后在595 nm波長下進行比色，并記錄吸光值(需重復實驗)。如表2所示，然后根據(jù)所得吸光度值(OD)帶入標準方程中計算蛋白質含量。按以下公式計算胎盤組織中所含胎盤肽的含量。

樣品蛋白質含量(mg/g鮮重)=[查得的蛋白質含量(μg)/樣品的重量(g)×1 000]×稀釋倍數(shù)

表2 樣品液的測定表

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析，用胎盤中3個不同部位的平均數(shù)±標準差表示此胎盤中胎盤肽分子質量和含量。

2 結果

2.1 豬胎盤肽分子量檢測結果

由圖1可看出6組份豬胎盤樣在14.4 ku處均有較為清晰的蛋白質條帶，其他條帶不明顯。對標準蛋白質樣品的分子質量的對數(shù)(lg Mr)和在分離膠中的相對遷移率(Rf)進行了回歸分析，繪制標準曲線(圖2)，并得出相應的線性回歸方程為y=-0.599 5Rf+1.316 7，r=0.993 2。從標準蛋白曲線中查得6組豬胎盤中胎盤肽分子質量分別為14.219、13.801、12.012、12.357、11.326、10.197 ku，明確表明豬胎盤中含有小分子多肽。

A、B、C、D、E、F分別為6組豬胎盤肽樣品相對分子質量條帶

A,B,C,D,E,F were relative molecular mass bands of 6 pig placental peptide samples

圖1豬胎盤肽和標準蛋白電泳圖

Fig.1 Pig placental peptide and standard protein electrophoresis

圖2 標準蛋白曲線

2.2 豬胎盤肽含量測定結果

2.2.1 標準曲線回歸方程建立 用分光光度計，以試劑空白對照做參比，在595 nm波長下測定標準蛋白溶液吸光度值(OD)。以蛋白質含量為橫坐標，吸光值(OD)為縱坐標繪制標準曲線(圖3)，并得出相應的線性回歸方程y=0.006x+0.014 9，r=0.998 3，曲線很好的符合郎伯-比爾(Lamber-Beer)定律。

圖3 牛血清白蛋白標準曲線

2.2.2 豬胎盤中胎盤肽的含量 由表3可知，6組胎盤中胎盤肽的含量不同，且同一胎盤不同部位胎盤肽的含量也不相同。6組豬胎盤中胎盤肽的平均含量分別為0.67 mg/g±0.07 mg/g、0.82 mg/g±0.03 mg/g、0.81 mg/g±0.02 mg/g、0.70 mg/g±0.11 mg/g、0.79 mg/g±0.03 mg/g及0.84 mg/g±0.04 mg/g。

表3 豬胎盤肽含量測定結果

3 討論

3.1 胎盤肽的提取工藝

動物體內的生物活性肽主要源于蛋白質，對于活性肽的提取首先應考慮到如何將其蛋白質更好的溶解釋放，同時盡可能少的破壞其多肽結構。提取動物組織中多肽首先要使組織細胞破碎和固液分離，這一步也是分離純化階段的重要環(huán)節(jié)。細胞破碎的方法通常有組織勻漿法、超聲波破碎法和酶解法，前兩種方法即為物理方法提取活性多肽，其原理均是通過外力將細胞破碎，使細胞中的多肽或蛋白質進入到溶液中，然后進行下一步的提取純化。酶解法即是利用生物酶制劑將細胞壁或者細胞膜充分溶解和消化，使其細胞內的蛋白質和多肽等內容物釋放溶解，但應用此方法需嚴格掌握酶的專一性以及反應條件，只有選擇合適的酶，并且在適應的溫度和pH條件下才能充分酶解釋放胞內物質而不過多破壞其結構。以上幾種方法的最終目的以及基本原理都是將細胞破碎后釋放出胞內物質，但目前超聲波破碎法和酶解法均無成套的關鍵技術，制作工藝復雜，成本較高，不具備大批量生產(chǎn)的條件。本試驗采用組織勻漿法獲得了透明清亮較為優(yōu)質的豬胎盤肽，相比之下，組織勻漿法工藝較簡單，關鍵技術較為成熟，且適合大規(guī)模生產(chǎn)。

3.2 豬胎盤肽分子質量測定分析

用SDS-PAGE分離鑒定蛋白質，其有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，即膠體孔徑的大小，分離膠濃度越大，其孔徑越小，孔徑的大小直接影響到蛋白質分離的效果。汪建雄等[7]研究發(fā)現(xiàn)分離膠濃度為100 g/L、120 g/L時，膠體孔徑過大，得不到清晰條帶，當分離膠濃度為150 g/L時條帶效果得到改善，分離膠濃度達180 g/L、200 g/L時條帶效果較清晰，當濃度達250 g/L時，電泳受阻嚴重,說明分離膠孔徑已經(jīng)太小。對于小分子多肽(Mr<10 ku)而言，即使用高濃度聚丙烯酰胺凝膠的 SDS-PAGE 也不能夠完全分離，由于在含SDS 緩沖液的樣品中，小分子肽的濃縮較為困難，因為二者成為復合體后所帶的電荷和大小皆與SDS本身類似，因此小分子多肽的濃縮對SDS-PAGE 來說就成了一個突出問題[8]。

本試驗采用改良后的Tricine-SDS-PAGE電泳法[5]對豬胎盤肽相對分子質量進行測定，得到了較為清晰的條帶，改良后的Tricine-SDS-PAGE中加入的尿素在一定程度上能夠有效的減少小分子多肽與SDS的結合量，而甘油則能緩解間隙膠和分離膠快速聚合時引起的斷層問題[9]。由電泳結果可知6組豬胎盤肽分子質量分別為14.219、13.801、12.012、12.357、11.326、10.197 ku。這與李小梅[10]所報道的豬胎盤肽分子質量(14.4 ku)相差較小，而與周國華等[11]所測得的豬胎盤肽分子質量(6 ku)結果相差較大，這可能與豬的品種以及胎次或是提取工藝的不同有關，其真正原因有待于進一步的研究。同時，由圖1可以看出6條樣品帶中A組和D組條帶顏色較淺，也許是樣品的濃度不夠高而導致，由此猜測不同胎盤或是同一胎盤的不同部位其胎盤肽的含量是不同的。

3.3 豬胎盤肽含量的測定分析

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量已經(jīng)得到廣泛的應用，被眾多科研工作者認為是一種穩(wěn)定而可靠的蛋白質測定方法。此方法對儀器設備的要求不高，簡便而精準，據(jù)估計考馬斯亮藍法比紫外吸收法靈敏10倍～20倍，比Lowry法約高4倍[12]。但是環(huán)境溫度、光照強度、蛋白質孵育溫度及時間等因素對試驗結果的準確性均有較大影響[13-14]。本試驗應用考馬斯亮藍法，對豬胎盤中胎盤肽的含量進行測定，由結果可知，6組豬胎盤中胎盤肽的含量分別為0.67 mg/g±0.07 mg/g、0.82 mg/g±0.03 mg/g、0.81 mg/g±0.02 mg/g、0.70 mg/g±0.11 mg/g、0.79 mg/g±0.03 mg/g及0.84 mg/g±0.04 mg/g，這與周國華所報導的豬胎盤肽含量相差較大，這可能與以上提出的影響因素有關。從試驗結果中得知不同豬胎盤中胎盤肽的含量不同，且同一胎盤中不同部位的胎盤肽含量也不相同，這可能與豬的品種以及豬的體質或是胎次有關，具體原因還需要進一步研究。

參考文獻:

[1] 侯銀臣,吳 麗,劉旺旺,等.羊胎盤免疫活性肽的制備及其活性[J].中國食品學報,2016,16(1):123-129.

[2] 唐文林.豬胎盤綜合利用工藝與應用研究[D].江南大學,2014.

[3] 王 晶,林志穎,林立梅,等.牛羊胎盤免疫調節(jié)因子的提取及對PANC-Ⅰ增殖和遷移影響的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2016,24(12):1863-1871.

[4] 任興宏.羊胎盤免疫活性小分子肽的分離純化[D].西南大學,2010.

[5] 周國華,孟凡軍,王永志,等.羊和豬胎盤肽的制備及其生物活性的初步研究[J].家畜生態(tài)學報,2006,27(3):000019-22.

[6] 姜亦超,白洪健,郭 鸰,等.考馬斯亮藍法測定糞便中蛋白質含量及應用[J].食品研究與開發(fā),2013,34(21):77-79.

[7] 汪建雄,隋秀芝.用SDS-PAGE電泳法測定小分子多肽分子量的研究[J].絲綢,2001(12):44-45.

[8] Cleveland D W,Fischer S G,Kirschner M W,et al.Peptide mapping by limited proteolysis in SDS and analysis by gel electrophoresis[J].J Biol Chem,1977,252(3):1102-1106.

[9] 馬興亮.奶山羊胎盤肽的分離提純及其對小白鼠免疫功能的影響[D].山東農(nóng)業(yè)大學,2008.

[10] 李小梅.豬胎盤肽凍干粉的制備及功效考察[D].揚州大學,2016.

[11] 周國華.家畜胎盤肽的制備及其生物活性的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學,2006.

[12] 周躍男,王 湛,趙小川,等.淺談蛋白質含量的定量檢測方法[J].食品研究與開發(fā),2014(7):127-130.

[13] 趙 卓,籍浩天,劉東波,等.光照對考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度影響的研究[J].吉林師范大學學報(自然科學版),2015(2):112-116.

[14] Zhao Z,Ya-Ru J I,Hao-Tian J I,et al.Effects of temperature on determination of protein concentration with Coomassie brilliant blue method[J].J Anhui Agri Sci,2015.