沈清清，陳紅惠，劉 芳

（1.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099;2.文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

根瘤菌（rhizobium）廣泛分布于土壤中，屬革蘭氏陰性菌，傳統(tǒng)觀念認為根瘤菌是一類從豆科植物根部入侵并與之共生后形成根瘤，能行使自身固氮功能的細菌[1]。近年來，隨著多基因序列分析與全基因組序列測定等分子技術(shù)的發(fā)展和多種分類方法的推廣，根瘤菌的分類學(xué)研究發(fā)生了巨大的變化，例如新的屬種不斷推出、對屬種的命名和劃分產(chǎn)生許多爭議，特別是新的研究報道根瘤菌不僅包含共生固氮細菌，同時也包含了非共生固氮的細菌[2]，這一發(fā)現(xiàn)徹底顛覆了人們對根瘤菌傳統(tǒng)觀念上的認識。

目前，根瘤菌主要依據(jù)16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析來確定其菌種的分類地位，但在16S rRNA全序列分析存在一些缺陷，一方面16S rRNA具有高保守性可能會限制種以下的分類，另一方面由于生物間存在基因水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，僅依賴16S rRNA的分析會使分類體系產(chǎn)生偏差或混亂[3]。因此有必要提出或補充根瘤菌菌種鑒定更為可靠的方法和依據(jù)。FtsZ蛋白是一類微管蛋白，與細胞分裂密切相關(guān)，幾乎存在于所有的原核和真核生物中，研究發(fā)現(xiàn)原核生物與真核生物的FtsZ蛋白在進化上由共同祖先進化而來，具有保守性，適合于細菌系統(tǒng)分類學(xué)研究[4]。張斌等[5]將FtsZ 蛋白應(yīng)用于乳酸菌的系統(tǒng)分類研究中，發(fā)現(xiàn)FtsZ 蛋白序列的分辨率高于16S rRNA， 更適用于乳酸菌種間的系統(tǒng)分類研究。

本文從NCBI中調(diào)取了根瘤菌6個屬共29個菌種的FtsZ 蛋白，從FtsZ 蛋白的角度對根瘤菌進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，探討根瘤菌物種之間的進化關(guān)系，并與最新的根瘤菌分類情況進行了比較。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從美國生物信息中心（National Center for Biotechnology information）的蛋白數(shù)據(jù)庫調(diào)出根瘤菌與其它菌屬FtsZ蛋白的數(shù)據(jù)，人工對氨基酸序列逐條分析，獲得非冗余完整FtsZ蛋白共32條[6]。

1.2 序列比對

利用程序Custal W將FtsZ蛋白氨基酸序列進行比對，再采用蛋白及核酸分析工具ESpript 3.0 分析序列比對圖，之后對比對圖進行美化與加工。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用生物核酸與蛋白序列比對軟件Clustalx 2.0將32條FtsZ蛋白序列進行比對分析，根據(jù)比對結(jié)果用 MEGA 7.0 構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進化樹[7]；Bootstrap 分析中使用 1 000 次重復(fù)計算 NJ 樹的支持率。采用生物信息學(xué)方法分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)的選擇

如表1所示，經(jīng)過篩選和分析，最終從NCBI根瘤菌蛋白數(shù)據(jù)庫中下載了29個菌種的FtsZ蛋白（序列登錄號見表1）作為研究對象，這29個菌種分別屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、土壤根瘤菌屬（Agrobacterium）、中華慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）和貪銅菌屬（Cupriavidus）；另外還下載了埃希氏菌屬（Escherichia）下3個菌種的FtsZ蛋白作為外群。從表1所列數(shù)據(jù)可以看出，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）與β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）相比FtsZ蛋白氨基酸序列長度差異較大，歸屬α-變形菌綱的根瘤菌氨基酸序列長度在546～609區(qū)間；而歸屬于β-變形桿菌綱則在393～444區(qū)間。

表1 FtsZ蛋白相關(guān)信息

續(xù)表1：

2.2 FtsZ蛋白序列比對分析

從表1所列的每一屬里選擇模式菌種為代表進行序列比對，獲得比對圖（見圖1），這些進行比對的氨基酸序列長度最小為398aa，最長為601aa，比對寬度為607 Residues。

圖1 氨基酸序列比對

圖1結(jié)果顯示具有同一性的氨基酸共有147個，占24.22%；高度相似的氨基酸共有85個，占14.00%，相似度較低的共有41個，占6.75%，一致性大于50%，同時我們也看到，F(xiàn)tsZ蛋白中保守區(qū)域主要在425 Residues之前，盡管根瘤菌屬與慢生根瘤菌屬FtsZ蛋白的氨基酸序列較長，但自424Residue之后的氨基酸隨機性較大，在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的研究意義不大。

2.3 FtsZ蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Clustalx 2.1程序?qū)⒈?所列的32種細菌FtsZ蛋白序列進行比對分析，通過掐頭去尾并優(yōu)化處理后獲得比對文件，再利用MEGA 7.0軟件將上述文件激活并制作系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示獲得系統(tǒng)發(fā)育拓撲結(jié)構(gòu)圖。

圖2 FtsZ蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討論

由圖2可看出，F(xiàn)tsZ蛋白成功將根瘤菌進行聚類，埃希氏菌屬的3個菌種歸為外群，根瘤菌下歸屬為兩大分支，第一大分支為伯克霍爾德菌屬和貪銅菌屬聚類，這兩個屬的細菌均屬于β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）；第二大分支主要為根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、土壤根瘤菌屬和中華慢生根瘤菌屬聚類，這4個屬的細菌均屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），這一結(jié)果與最新版本的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》和近年來國內(nèi)外文獻中對根瘤菌的系統(tǒng)分類基本一致[2，8]，而這些系統(tǒng)主要是以細菌的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育為依據(jù)， 表明FtsZ蛋白作為分子指標具有較高的可靠性。另外，在以上32種細菌FtsZ蛋白氨基酸序列長度差異度較大的情況下，系統(tǒng)發(fā)育樹也能明顯將埃希氏菌屬菌種歸于外群，說明在本實驗數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，F(xiàn)tsZ蛋白的敏感度和分辨力高于16S rRNA 。

一直以來，無論從形態(tài)學(xué)的角度還是分子指標16S rRNA 的角度來看，Agrobacterium和Rhizobium相似度非常大，因此學(xué)術(shù)界不斷有學(xué)者提出將兩個屬合并為一個屬，從圖2系統(tǒng)發(fā)育樹我們發(fā)現(xiàn)兩個屬的根瘤菌同樣也被歸屬到了同一分支下，表明從FtsZ蛋白的角度出發(fā)兩個屬也極為相似。另外，值得注意的是圖2還將Burkholderia dolosa、Cupriavidus nantongensis這兩個屬于β-變形桿菌綱的菌種和Mesorhizobium plurifarium聚類到一起并歸屬在第二大分支里，而第二大分支的其它菌種均屬于α-變形菌綱。自1898年Frank首次提出根瘤菌屬這一概念以來[9]，很長一段時間人們認為根瘤菌僅分布在α-變形桿菌綱內(nèi)，直到2001年隸屬于β-變形桿菌綱的根瘤菌被發(fā)現(xiàn)后[8]，人們的認識才發(fā)生歷史性的轉(zhuǎn)變——原來根瘤菌不僅僅存在于α-變形桿菌綱內(nèi)。從本研究的結(jié)果來看Burkholderia dolosa與Cupriavidus nantongensis兩個菌種的關(guān)系與α-變形菌綱根瘤菌的親緣關(guān)系更為接近，再次證明僅依靠α-變形桿菌綱這一大概念將根瘤菌涵蓋是錯誤的觀念。多年來根瘤菌系統(tǒng)學(xué)與分類學(xué)上一直存在著許多爭議，不同的分類和鑒定指標都存在著或多或少的偏差[10-15]，無論怎樣，我們的目的就是為了認識根瘤菌進化的起源與進化軌跡，尋找保守性較高和變異度適宜的分子指標是根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)重要的基礎(chǔ)工作，隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，學(xué)者發(fā)現(xiàn)氨基酸序列能提供比核酸序列可信度更高的分析結(jié)果[7]，本研究也表明細菌FtsZ蛋白在根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究方面具有較高的應(yīng)用價值和意義，有必要結(jié)合大數(shù)據(jù)繼續(xù)利用生物信息學(xué)手段進行更深入的研究，挖掘根瘤菌更多的進化奧秘。

4 結(jié)論

（1）根瘤菌各屬模式菌種FtsZ蛋白序列比對結(jié)果表明，序列中同一性的氨基酸共有147個，占24.22%；高度相似的氨基酸共有85個，占14.00%，相似度較低的共有41個，占6.75%，一致性大于50%，F(xiàn)tsZ蛋白中保守區(qū)域主要位于425 Residues之前。

（2）以FtsZ蛋白為分子指標制作的系統(tǒng)發(fā)育樹與最新版本的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》和近年來國內(nèi)外文獻中對根瘤菌的系統(tǒng)分類基本一致，同時有些細微差異也與學(xué)術(shù)界提出的爭議相吻合。

（3）FtsZ蛋白在根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究方面具有較高的分辨力。

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