滿 嬌，張 武

（大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003）

青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種植物細菌性疾病，可侵染許多重要經(jīng)濟作物（如馬鈴薯、花生、番茄、煙草、甘薯、茄子等）以及一些貴重藥材和花卉，特別是對茄科植物的危害更大[1]。青枯病是世界上危害最大、分布最廣和造成損失最為嚴重的植物病害之一，該病的發(fā)生、傳播和防治一直是國內(nèi)外研究的重點和熱點。

青枯雷爾氏菌作為革蘭氏陰性菌的一種，可通過分泌效應(yīng)物[2]（effectors，專指病原菌分泌到宿主植物體內(nèi)的分泌蛋白）引起致病侵染，研究其分泌機制對于病原菌的致病機理具有重要意義[3]。分泌蛋白是由細胞合成并分泌到質(zhì)膜外的蛋白質(zhì)，分為兩大類，一類是經(jīng)典分泌蛋白（classical secreted protein），該類分泌蛋白的N-端含有16～26個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽；另一類為非經(jīng)典分泌蛋白，這類分泌蛋白缺少信號肽，III型分泌系統(tǒng)（type III secretion systems，T3SS）產(chǎn)生的分泌蛋白即為信號肽非依賴性。III型分泌蛋白作為重要的效應(yīng)物蛋白，在許多植物-病原微生物互作過程中發(fā)揮極其關(guān)鍵的作用[4]。

分泌蛋白的研究可以用實驗檢測和理論預(yù)測兩種方法。常規(guī)的蛋白質(zhì)實驗檢測可以用western blot和Elisa（酶聯(lián)免疫吸附測定），而Matthew等使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀，通過對細菌蛋白質(zhì)組特異性修飾，可以直接從菌落中檢測細菌的分泌蛋白，甚至識別病原菌的毒力和侵染蛋白質(zhì)[5]。近年來，隨著生物信息學(xué)和第三代單分子測序的迅猛發(fā)展，利用已有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫去預(yù)測和分析分泌蛋白，進而通過實驗驗證已成為蛋白質(zhì)組研究的常用手段，可以大大減輕繁瑣的實驗工作量。本文對青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白的預(yù)測及分析，將有助于深入研究病原菌和宿主植物互作的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗材料是青枯雷爾氏菌全蛋白質(zhì)組的5 116個蛋白質(zhì)，氨基酸序列由NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。青枯雷爾氏菌基因組大小約5.8 Mb，是由3.7 Mb的環(huán)形染色體和2.1 Mb的大質(zhì)粒所組成，具有高GC含量。

1.2 方法

EffectiveDB（http://www.effectors.org/）是一個預(yù)測III型分泌系統(tǒng)的工具，主要功能是預(yù)測蛋白質(zhì)是否具有III型分泌特征。EffectiveCCBD預(yù)測是否有伴侶蛋白結(jié)合在分泌蛋白25～70位氨基酸結(jié)合位點上，伴侶蛋白的目的是提高III型分泌蛋白在分泌前及分泌時的穩(wěn)定性，這是III型分泌系統(tǒng)所產(chǎn)生的分泌蛋白的特別屬性。

本文首先用EffectiveDB和EffectiveCCBD篩選出含有III型分泌系統(tǒng)的分泌蛋白，其次分別使用信號肽預(yù)測軟件SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和非經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測軟件SecretomeP2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）剔除掉可能含有信號肽的分泌蛋白，再結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件SMART、ExPASy在線分析III型分泌蛋白的結(jié)構(gòu)、功能并進行常規(guī)特征描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 III型分泌蛋白的預(yù)測

利用EffictiveDB、EffectiveCCBD、SignalP4.1和SecretomeP2.0對青枯雷爾氏菌的5 116個蛋白質(zhì)氨基酸序列進行預(yù)測和分析，共得到156個III型分泌蛋白，約占蛋白質(zhì)總數(shù)的3.05%。

2.2 III型分泌蛋白的功能預(yù)測及分析

經(jīng)過預(yù)測后，對其功能進行初步分析，發(fā)現(xiàn)在156個III型分泌蛋白中，75個為有功能描述的蛋白質(zhì)，81個為假定蛋白（hypothetical protein）。圖1為156個蛋白質(zhì)的功能分類。

細菌T3SS分泌的效應(yīng)蛋白大致可分為4類[4]：第一類為細胞質(zhì)膜上的分泌系統(tǒng)自身組裝蛋白；第二類為轉(zhuǎn)位子蛋白，主要能在細胞膜上形成跨膜通道，使效應(yīng)蛋白通過；第三類為分泌的效應(yīng)蛋白，這是T3SS產(chǎn)生的關(guān)鍵效應(yīng)物，這類蛋白與病原微生物的致病侵染密切相關(guān)，被轉(zhuǎn)移進入寄主細胞引起相應(yīng)的病理變化；第四類為T3SS 伴侶蛋白，與特異的效應(yīng)蛋白結(jié)合，保護效應(yīng)物在未分泌前不被降解，并能有效地分泌、轉(zhuǎn)移效應(yīng)蛋白。前兩大類蛋白質(zhì)，一共有31個（圖1B），約占整個III型分泌蛋白的20%，由此可見，細菌T3SS在組裝自身分泌裝置方面消耗了大量的能量與精力。在有功能描述的分泌蛋白中，編碼III型分泌系統(tǒng)的許多結(jié)構(gòu)基因與編碼細菌的鞭毛裝置基因具有一定的同源性[6]，鞭毛蛋白在細菌表面組裝鞭毛裝置，可能同分泌蛋白運輸?shù)剿拗黧w內(nèi)有關(guān)。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心而命名的蛋白水解酶，在真菌中絲氨酸蛋白酶與病原菌的侵染密切相關(guān)，通常用來降解宿主植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)[7]，這說明絲氨酸蛋白酶可能與青枯雷爾氏菌的侵染相關(guān)。

圖1 青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白功能分類

在其它III型分泌蛋白中，還發(fā)現(xiàn)了青霉素結(jié)合蛋白和熱休克蛋白，這兩種蛋白質(zhì)在其它微生物中廣泛存在[8]，是病原微生物在逆境條件下抗脅迫的分子基礎(chǔ)，可以擴大細菌在不良環(huán)境中的耐受性和生存范圍。在本次預(yù)測中還發(fā)現(xiàn)了AvrA蛋白，藺志杰[9]發(fā)現(xiàn)在腸炎沙門菌中AvrA效應(yīng)蛋白為抑制炎癥分子，在腸炎沙門菌感染宿主過程中可抑制宿主細胞的過度炎性反應(yīng)，推測此種III型分泌蛋白在青枯雷爾氏菌中可能也有抑制宿主植物過敏反應(yīng)的功能。HrpB和HrcU （hypersensitive response，HR，過敏反應(yīng)）主要功能是抑制宿主植物的基礎(chǔ)抗性或者防衛(wèi)反應(yīng)，調(diào)控其他T3SS相關(guān)基因的表達。另外，通過位置分析，發(fā)現(xiàn)HrcU和HrpB等4個III型分泌蛋白的基因集中位于青枯雷爾氏菌的大質(zhì)粒上，有可能形成一個“毒力島”，這與很多病原微生物的毒力蛋白基因分布是高度一致的[10-11]。表1是部分青枯雷爾氏菌III型分泌蛋白的常規(guī)特征描述，由 ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析完成。

表1 部分典型III型分泌蛋白特征描述

為了更好的分析III型分泌假定蛋白在青枯雷爾氏菌中的功能，我們用SMART軟件進行結(jié)構(gòu)域分析。Hemolysin Cabind是在假定蛋白中含量最多的一種結(jié)構(gòu)域，包括HlyD結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域功能與表1中鈣結(jié)合溶血素蛋白功能類似，是一種鈣結(jié)合細菌溶血素蛋白，含有此類結(jié)構(gòu)的分泌蛋白可能在鈣離子的介導(dǎo)下進入到宿主植物體內(nèi)，與細菌產(chǎn)生毒力和致病性有關(guān)（Hemolysin Cabind等結(jié)構(gòu)域功能在歐洲分子生物學(xué)實驗室EMBL-EBI網(wǎng)站的PFAM中查詢）；假定蛋白中的Flagellin_N結(jié)構(gòu)域與鞭毛組裝有關(guān)，可能參與青枯雷爾氏菌T3SS系統(tǒng)的組裝。

5 結(jié)論

本文主要利用生物信息學(xué)工具來預(yù)測和分析青枯雷爾氏菌的III型分泌蛋白及其功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，III型分泌蛋白作為重要的致病因子，除部分蛋白質(zhì)功能未知外，還包括有外膜/孔道蛋白、鞭毛蛋白、抗應(yīng)激蛋白、絲氨酸蛋白酶、鈣結(jié)合溶血素蛋白等類型，主要參與了鞭毛合成、毒力侵染等過程。

目前，由青枯雷爾氏菌引起的病害是災(zāi)難性的，所以，對其基因組和蛋白質(zhì)組進行生物信息學(xué)分析、掌握分泌蛋白的致病侵染的機制非常必要。本文改進的方法是結(jié)合實驗檢測方法，可以提取青枯雷爾氏菌的分泌蛋白進行分離純化和分析鑒定，且在代謝組水平上全面分析基因的功能和彼此形成的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。了解青枯雷爾氏菌在寄主植物體內(nèi)的致病機理，對于青枯病的控制具有重要的現(xiàn)實意義。

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