陳秀娟, 黃宇鋒, 劉香梅, 龐增雄, 江 漪, 李培寧, 李光先, 陳梓靈, 孫 俠, 王 強

(廣州質量監(jiān)督檢測研究院, 廣州 511447)

1,2-己二醇(1,2-Hexanediol )是一種多元醇，無色無味, 主要用于化妝品制造、醫(yī)藥制造、食品加工、噴墨制造等行業(yè)[1]。1,2-己二醇是一種具有很寬的抗菌廣譜性和高活性的原料，目前化妝品制造商正在研究用1,2-己二醇替代苯甲酸類、甲醛類供體和苯氧乙醇類用于化妝品的防腐控制[2,3]。我國《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)視防腐劑為限用物質，并對防腐劑的種類及使用量作了嚴格的規(guī)定[4], 但1,2-己二醇并未被列入防腐劑的范疇, 也未對其作出安全使用量的說明。因此有必要對1,2-己二醇的安全性進行評價, 為1,2-己二醇在化妝品中的使用提供毒理學數(shù)據(jù)。近年來基于動物福利及科學技術的進步, 多種替代動物試驗的體外方法得到開發(fā)和應用[5]。其中牛眼角膜混濁/滲透性試驗(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)和雞胚絨毛尿囊膜試驗(hen’s egg test - chorioallantoic membrane,HET-CAM) 是目前國內(nèi)外比較常用的眼刺激性/腐蝕性的體外替代方法。由于每一個替代方法均有其局限性，因此通常采用組合策略, 以實現(xiàn)減少動物試驗或完全覆蓋動物試驗所顯示的刺激性范圍[5]。本文采用自下而上的組合策略，在符合動物實驗“3R”原則基礎上對1,2-己二醇是否引起眼刺激性/腐蝕性反應進行安全性評價。

1 材料與方法

1.1 受試物

1,2-己二醇為無色無味透明液體，由廣州廣曼生物科技有限公司提供，批號為BNB-C301017，純度為99.87%。使用前用滅菌生理鹽水稀釋至相應的濃度。陰性對照物采用生理鹽水質量分數(shù)(0.9%NaCl, NS), 陽性對照物采用無水乙醇及NaOH溶液(0.1 mol/L)。生理鹽水購自廣東科倫藥業(yè)有限公司; 無水乙醇購自廣州市中南化學試劑有限公司，批號150831，純度為分析純; NaOH購自廣州化學試劑廠，批號20150401-1，純度為分析純。

1.2 實驗材料及培養(yǎng)基

SPF級雞胚由北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2014-0002]; 離體牛眼角膜由華代生物科技有限公司提供; 新西蘭兔由廣州市花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場提供[SCXK(粵)2014-0023]。動物飼養(yǎng)于屏障設施[SYXK(粵)2014-0137]。MEM培養(yǎng)基、Hanks平衡鹽溶液均由美國Life Technologies Corporation 公司提供。

1.3 主要儀器

德國BASF公司 Opacitometer Kit3.0型混濁度測量儀; 美國伯樂公司iMARK型酶標儀; 上海一恒科學儀器有限公司LRH250F型生化培養(yǎng)箱; 德國蔡司公司Stemi-2000C型體視顯微鏡。

1.4 試驗方法

1.4.1 自下而上的分層測試組合策略 對不同濃度的1,2-己二醇進行測試，即用HET-CAM試驗，鑒別受試物是否為“無刺激性”或“刺激性”; 如結果為“無刺激性”，則無需另外測試，如結果為“刺激性”，再進行BCO P試驗，區(qū)分“無刺激性”或“刺激性”的濃度范圍；依據(jù)BCOP試驗結果，對“刺激性”的濃度進行體內(nèi)動物試驗，最終確認1,2-己二醇無眼刺激性的最高濃度(試驗流程見圖1)。

圖1 多層試驗組合策略

1.4.2 HET-CAM試驗 按進出口行業(yè)標準SN/T 2329-2009進行操作[6], 用照蛋器選取受精正常且有活力的9日齡雞胚, 去除氣室部位蛋殼，加1～2 mL生理鹽水溶液濕潤蛋膜，把多余的液體傾出后去除內(nèi)膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜(CAM)，通過觀察血管系統(tǒng)結構的完整性選擇合適的雞胚用于實驗。分別取0.3 mL各濃度的受試物滴加于CAM表面，采用時間評價法(連續(xù)模式評分) ，即觀察5 min 內(nèi)CAM 血管變化并記錄CAM 血管充血、出血和凝血出現(xiàn)的初始時間(s)，根據(jù)觀察結果，計算刺激分值(irritation score，IS)(見公式1)。根據(jù)進出口行業(yè)標準SN/T 2329-2009對HET-CAM實驗結果按眼刺激時間評價法的分類標準進行分類(表1)。

式中: secH 出血時間(s); secL 血管融解時間(s);secC凝血時間(s)

表1 HET-CAM試驗IS眼刺激時間評價法的分類標準

1.4.3 離體組織型的BCOP試驗 參考亞太經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD) 測試指南437進行操作[8]，分離角膜，用Hanks鹽溶液清洗3遍，將角膜固定于角膜挾持器中，加入含體積分數(shù)1%胎牛血清的MEM無酚紅培養(yǎng)液填滿后室和前室，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，更換新的培養(yǎng)液，用濁度儀測量角膜濁度本底值，選擇合適的角膜用于實驗。移除前室中的無酚紅MEM培養(yǎng)液, 加入750 μL各濃度的受試物, 暴露染毒10 min。染毒結束后,進行清洗程序, 清洗后用無酚紅的MEM培養(yǎng)液充滿前房。置32 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后更換無酚紅MEM培養(yǎng)液。測量角膜濁度值。測量完畢后前室的無酚紅MEM培養(yǎng)液更換為1.0 mL質量分數(shù)0.4%熒光素鈉溶液，繼續(xù)培養(yǎng)90 min, 收集后室全部液體, 混勻后用酶標儀在490 nm處測量角膜吸光度(A)值。計算體外刺激評分值(in vitroirritancy score，IVIS) (公式2)。根據(jù)OECD 437指南和聯(lián)合國全球化學品統(tǒng)一分類和標識制度(UN GHS)，對BCOP 眼刺激實驗結果進行UN GHS分類(表2)。

表2 BCOP試驗IVIS 值與刺激性UN GHS 分類標準

1.4.4 兔眼刺激試驗(Draize試驗) 依據(jù)《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)進行[4]。給予不同濃度的1,2-己二醇后, 于給藥后30 s用生理鹽水進行沖洗, 觀察兔角膜、虹膜和結膜各自在24 h、48 h和72 h的刺激反應, 根據(jù)刺激反應積分的均值和恢復時間評價, 按規(guī)范所述的分級判定其眼刺激性的強度。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，用單因素方差分析(ANVOA)進行q檢驗。組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

CAM與體積分數(shù)0.312%～10.00%的1,2-己二醇接觸后，在體視顯微鏡下均觀察到出現(xiàn)不同程度的充血、出血和凝血，IS積分隨著1,2-己二醇濃度的增加呈上升趨勢，詳見表3。

2.1 HET-CAM試驗

表3 不同濃度的1,2-己二醇HET-CAM試驗

2.2 BCOP試驗

依據(jù)HET-CAM試驗結果，對有刺激性的體積分數(shù)1.25%～10.00%1,2-己二醇進行BCOP試驗。不同濃度的1,2-己二醇與離體牛眼角膜接觸10 min，牛角膜混濁度和熒光素納滲透性均發(fā)生不同程度的改變。IVIS分值隨著1,2-己二醇濃度的增加而增加，表明1,2-己二醇對眼刺激性/腐蝕性程度有增強的趨勢, 體積分數(shù)10.00%時有嚴重腐蝕性(表4)。

2.3 Draize試驗

根據(jù)IVIS分值, 對有刺激性的體積分數(shù)2.50%～10.00% 的1,2-己二醇進行Draize試驗，結果體積分數(shù)2.50%～5.00%的1,2-己二醇為無刺激性，體積分數(shù)10.00%的1,2-己二醇對3只兔的結膜和角膜均造成不同程度的損傷，給藥后6 d恢復正常，有輕刺激性(表5)。

3 討論

正常情況下眼睛很少直接接觸外源性化學物，但在化妝品使用過程中，通常由于意外而使化妝品(例如潔面乳、眼部彩妝品等)以稀釋的形式進入眼睛產(chǎn)生刺激作用。目前我國的化妝品、農(nóng)藥、消毒產(chǎn)品、化學品等安全性毒理學評價的國家標準中采用傳統(tǒng)的兔眼實驗，是由Draize等[8]于1944年建立的，一直被認為是評價眼刺激性的金標準。但近年來，在動物福利的壓力下，國內(nèi)外的專家學者正嘗試建立代替?zhèn)鹘y(tǒng)動物實驗的體外方法，一些優(yōu)化的眼刺激性體外試驗方法陸續(xù)被驗證和認可。BCOP、HET-CAM是分別被OECD和歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)認可、驗證的方法，國內(nèi)學者的研究也已證實BCOP、HET-CAM可用于化妝品、消毒產(chǎn)品等眼刺激性的分類[9-11]。但到目前為止，還沒有體外試驗可以完全替代Draize試驗，體外試驗的預測范圍也沒有完全覆蓋Draize試驗所反映的損傷和炎癥的標準范圍。從本文各項體外替代試驗可見，在BCOP試驗中體積分數(shù)10.00%的1,2-己二醇有“嚴重腐蝕性”，而在動物試驗僅顯示為“輕刺激性”。BCOP只評估了角膜損傷，因而適于區(qū)分到重度眼刺激性物質，對于輕刺激和刺激性物質區(qū)分不夠敏感[12]。HET-CAM結構與眼結膜相似，通過觀察受試物對HET-CAM血管的作用評價受試物的眼刺激性，敖華英等[13]證實該法對于檢測中度以下的眼刺激性效果較好，能有效區(qū)分無刺激性物質。但HET-CAM試驗只模擬了Draize兔試驗的結膜反應，未考慮刺激反應的可逆性。鑒于此，考慮到BCOP和HET-CAM試驗在實驗應用方面具有一定的局限性，為了能在安全的前提下合理利用1,2-己二醇作為防腐體系，本研究在體外試驗的基礎上，采用少量的動物實驗最終確認1,2-己二醇最高無眼刺激性濃度為體積分數(shù)5.00%。

表4 不同濃度的1,2-己二醇暴露10 min后BCOP實驗

表5 不同濃度的1,2-己二醇Draize試驗

[1]李文. 高純度1,2-己二醇的合成研究[J]. 研究前沿, 2008,22(16):24-25.

[2]龔盛昭. 一種具有防腐功效的組合物及在化妝品中的應用[P]. 中國專利號: CN103494713B, 2015-05-06.

[3]姜炫守. 一種化妝品添加劑及化妝品[P].中國專利號:CN102379821A,2012-03-21.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范[M]. 北京:中國標準出版社, 2015:113-118.

[5]程樹軍, 焦紅. 實驗動物替代方法原理與應用[M]. 北京: 科學出版社, 2010:285-304.

[6]國家認證認可監(jiān)督管理委員會, 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準.SN/T 2329-2009化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗[S]. 北京: 中國標準出版社出版, 2009.

[7]OECD. OECD Guidelines for testing of chemicals, 437: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii)Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage[S]. Paris:2013.

[8]Draize J, Woodard G, Calvery H. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1944,82:377-390.

[9]黃健聰, 秦瑤, 程樹軍, 等. 牛角膜渾濁滲透試驗方法預測眼刺激性的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2014, 24(14):1980-1983.

[10]楊美玲, 黃俊明, 譚小華, 等. 雞胚絨毛膜尿囊膜試驗應用于抗菌洗液類產(chǎn)品毒性初篩研究[J]. 華南預防醫(yī)學, 2012,38(5):66-68.

[11]邱璐, 李小林, 卞俐娜, 等. 雞胚尿囊膜(HET-CAM) 眼刺激替代試驗對產(chǎn)品及原料評價的比較[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2011, 21(3):27-30.

[12]Casey W, Jacobs A, Maull E, et al. A new path forward: the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and National Toxicology Program's Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM)[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2015, 54(2):170-173.

[13]敖華英, 程樹軍, 潘芳, 等. 化妝品眼刺激試驗替代方法標準化與展望[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2012, 22(1):74-78.