鄭欣洵, 張智靜, 黃寶藝, 廖子君, 劉建軍, 羅 濤

(1. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院, 深圳518035;2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳518035;3. 深圳市疾病預(yù)防控制中心, 深圳518000）

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，通過與目的基因增強(qiáng)子位點(diǎn)中的特異性過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合，參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)等作用[1]。PPARγ是PPAR亞型之一，除了在脂肪細(xì)胞中表達(dá)以外，在免疫細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞以及B細(xì)胞均有表達(dá)[2,3]。目前研究[4,5]已表明，PPARγ與單核細(xì)胞對(duì)飲食引起的肥胖、胰島素抵抗和葡萄糖不耐受的敏感性有關(guān)。此外，PPARγ可抑制單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[6,7]并在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用[8,9]，而關(guān)于單核細(xì)胞上PPARγ是具有其它功能及其對(duì)應(yīng)的作用機(jī)制尚不明確。

條件性基因敲除(conditional knockout)通過將某種細(xì)胞特異性表達(dá)cre 重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠和靶基因鉗制小鼠雜交，得到在該種特定類型的細(xì)胞靶基因特異性敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠[10]。由于PPARγ在體內(nèi)多種細(xì)胞上均有表達(dá)，因此本課題通過特異性地敲除單核細(xì)胞上的PPARγ受體，為進(jìn)一步研究單核細(xì)胞PPARγ受體的功能及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

loxp轉(zhuǎn)基因純合子(PPARγloxp/loxp)小鼠，是在PPARγ基因第1和2外顯子的兩側(cè)重組添加loxp 位點(diǎn)。兩loxp 位點(diǎn)間的序列被刪除后將使PPARγ基因發(fā)生移碼突變; 單核細(xì)胞特異性表達(dá)cre重組酶純合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠，是在小鼠基因組插入 cre 酶基因，并且該基因可以通過單核細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子在單核細(xì)胞表達(dá) cre 重組酶。與loxp 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，則cre重組酶介導(dǎo)的重組能夠?qū)PARγ基因序列刪除，這些序列刪除具有細(xì)胞特異性，僅在單核細(xì)胞中發(fā)生。以上小鼠購自美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室，小鼠引進(jìn)后在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)及繁殖 [SYXK(粵)2015-0106]。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

他莫昔芬(美國(guó)Sigma公司)，基因組DNA提取純化試劑盒及PCR試劑盒(中國(guó)Vazyme公司), 細(xì)胞裂解液(中國(guó)碧云天公司)，蛋白酶抑制劑(美國(guó)MedChemExpress公司), BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國(guó)Biosharp公司)，PCR反應(yīng)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單核細(xì)胞PPARγ條件性基因敲除小鼠的建立將引進(jìn)的小鼠按1只雄性(PPARγloxp/loxp)小鼠: 2只雌性(Cx3cr1cre/cre)小鼠合籠，得到F1代，飼養(yǎng)至2～3周時(shí)采用RT-PCR方法鑒定小鼠基因型。再由F1代小鼠自交, 采用同樣的方法獲取F2代并鑒定其基因型, 篩選出基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre以及PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-小鼠, 為實(shí)驗(yàn)所需的PPARγ條件基因敲除小鼠即實(shí)驗(yàn)組(PPARγ-ko)，基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-小鼠為對(duì)照組(PPARγ-wt)。

1.3.2 單核細(xì)胞PPARγ基因特異性敲除及其鑒定將實(shí)驗(yàn)組小鼠飼養(yǎng)至4～6周齡時(shí)，連續(xù)5 d腹腔注射75 mg/kg他莫昔芬，注射結(jié)束后3 d內(nèi)提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將獲得的腹腔細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、分離及純化，用免疫熒光方法鑒定所提取細(xì)胞表型，再用Western blotting方法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)量。

1.3.3 PCR及水平電泳 采用PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf 6347)進(jìn)行PPARγloxp序列以及Cx3cr1cre序列的循環(huán)擴(kuò)增。引物序列見表1。采用凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)分析條帶。

1.3.4 免疫熒光 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，牛白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉后加入Iba1抗體(1∶1000，Wako)進(jìn)行熒光染色，DAPI封片后用熒光顯微鏡(Olympus)觀察圖片、拍照并保存。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR引物序列

1.3.5 Western blotting 用細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后，用Western blotting方法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PPARγ(1∶1000, Abcam)蛋白的表達(dá)水平，用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon)拍照并保存。

2 結(jié)果

2.1 F1代及F2代小鼠基因型鑒定

圖1是純合子PPARγloxp小鼠(PPARγloxp/loxp)和單核細(xì)胞特異性表達(dá)cre重組酶的Cx3cr1-cre小鼠(Cx3cr1cre/cre)雜交產(chǎn)生的F1代分別針對(duì)PPARγloxp序列(圖1A)和Cx3cr1Cre序列(圖1B)得到的條帶電泳鑒定結(jié)果。由圖1A可知, 1～6號(hào)小鼠為雜合子, 該小鼠單核細(xì)胞PPARγ基因只有一側(cè)插入loxp 序列, 基因型為PPARγloxp/-。圖1B結(jié)果表明, 1～6號(hào)小鼠為雜合子, 基因型為Cx3cr1cre/-。綜合以上結(jié)果可知, F1代小鼠均為雜合子, 基因型為 PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-。

圖2是F2代分別針對(duì)PPARγloxp序列(圖2A)和Cx3cr1Cre序列(圖2B)得到的條帶電泳鑒定結(jié)果。從圖2A可知2、4號(hào)小鼠為雜合子，該小鼠單核細(xì)胞PPARγ基因只有一側(cè)插入loxp 序列，基因型為PPARγloxp/-; 3號(hào)為野生型(wt)小鼠，該小鼠單核細(xì)胞PPARγ基因兩側(cè)無loxp序列插入，基因型為PPARγ-/-, 而1、5號(hào)小鼠為突變型且純合子，基因型為PPARγloxp/loxp, 為實(shí)驗(yàn)所需的基因型。由圖2B可知1、2號(hào)小鼠為雜合子, 基因型為Cx3cr1cre/-，3、4號(hào)小鼠為純合子，基因型為Cx3cr1cre/cre，5號(hào)為野生型小鼠，基因型為Cx3cr1-/-。結(jié)合圖2A及圖2B鑒定結(jié)果，1號(hào)小鼠基因型為PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-，是成功構(gòu)建的單核細(xì)胞PPARγ-ko小鼠，5號(hào)小鼠基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-是實(shí)驗(yàn)所需的PPARγ-wt小鼠。

2.2 單核細(xì)胞PPARγ基因特異性敲除鑒定

圖3A為IBA1標(biāo)記的腹腔巨噬細(xì)胞，圖3B為DPAI標(biāo)記的細(xì)胞核，圖3C為圖3A和圖3B的疊合圖片，從圖可知，所提取的腹腔細(xì)胞大部分為IBA1標(biāo)記的細(xì)胞，即為實(shí)驗(yàn)所需的巨噬細(xì)胞。

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組小鼠巨噬PPARγ蛋白表達(dá)量與對(duì)照組小鼠相比明顯降低，證明其巨噬細(xì)胞PPARγ基因被特異性敲除。

圖1 F1子代小鼠全組基因型鑒定圖

圖2 F2子代小鼠全組基因型鑒定圖

序號(hào)1～6為小鼠編號(hào); 圖1A及圖2A分別為F1子代和F2子代針對(duì)PPARγloxp序列擴(kuò)增得到的電泳結(jié)果; 圖1B及圖2B 分別為F1子代和F2子代針對(duì)Cx3cr1Cre序列擴(kuò)增得到的電泳結(jié)果

圖3 PPAR γ-ko小鼠腹腔細(xì)胞表型鑒定

圖4 PPAR γ-ko小鼠巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)

3 討論

條件性基因敲除主要利用噬菌體的 Cre/loxp系統(tǒng)，使目的基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官，獲得敲除目的基因的條件性基因敲除小鼠。本實(shí)驗(yàn)利用Cre/loxp系統(tǒng)及孟德爾遺傳定律構(gòu)建PPARγ條件基因敲除小鼠。將引進(jìn)的進(jìn)口雄性loxp轉(zhuǎn)基因純合子(PPARγloxp/loxp)小鼠與雌性單核細(xì)胞特異性表達(dá)cre重組酶純合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠進(jìn)行雜交, 得到的F1代通過RT-PCR方法鑒定其基因型均為雜合子，基因型為PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-(圖1)，該鑒定結(jié)果與孟德爾遺傳定律相符。

將得到的F1代進(jìn)行自交，理論上產(chǎn)生的F2代基因型有以下9種可能: PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/cre、PPARγ-/-Cx3cr1cre/cre、PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-、PPARγ-/-Cx3cr1cre/-、PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-、PPARγloxp/-Cx3cr1-/-、PPARγ-/-Cx3cr1-/-。其中基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠其單核細(xì)胞PPARγ基因位點(diǎn)兩側(cè)插入了方向相同的重組loxp 序列且表達(dá)Cx3cr1基因的細(xì)胞插入了cre重組酶基因，在雌激素誘導(dǎo)下激活的cre重組酶可識(shí)別loxp序列，特異性敲除PPARγ基因, 因此基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-的小鼠即為巨噬細(xì)胞PPARγ-ko小鼠; 而基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-的小鼠其單核細(xì)胞PPARγ基因位點(diǎn)兩側(cè)雖然均插入了重組的loxp 序列，但是其表達(dá)Cx3cr1基因的細(xì)胞并無cre重組酶基因的插入，因?yàn)?，其體內(nèi)不存在識(shí)別loxp序列的酶，即使雌激素誘導(dǎo)下亦無法敲除PPARγ基因，即為PPARγ-wt小鼠。因此, 由圖2可知，僅有1號(hào)小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-)是成功構(gòu)建的單核細(xì)胞PPARγ-ko小鼠，而5號(hào)小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-)為PPARγ-wt小鼠。

IBA1是小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，在成功構(gòu)建單核細(xì)胞PPARγ-ko小鼠后, 根據(jù)以往腹腔巨噬細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法[11,12], 提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞, 利用IBA1對(duì)所提取腹腔細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記證實(shí)所提取的腹腔細(xì)胞大部分為巨噬細(xì)胞(圖3)。同時(shí)利用Western blotting法驗(yàn)證PPARγ-ko小鼠及PPARγ-wt小鼠巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)情況，其結(jié)果表明基因型為PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)后可特異性敲除小鼠單核細(xì)胞PPARγ基因。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要?jiǎng)游锬Ｐ?，通過構(gòu)建單核細(xì)胞PPARγ條件敲除小鼠，就可以在整體動(dòng)物水平研究PPARγ的作用，進(jìn)一步地研究單核細(xì)胞PPARγ在人體各個(gè)臟器相關(guān)疾病中發(fā)揮的作用及其主要機(jī)制，對(duì)臨床上治療和預(yù)防相關(guān)的疾病提供理論依據(jù)。

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