梁 磊, 董 敏, 尤金煒, 胡文娟, 陳 莉, 惲?xí)r鋒

(解放軍南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科, 全軍實(shí)驗(yàn)動物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地, 南京 210002)

目前，實(shí)驗(yàn)動物福利的重要性已得到了普遍認(rèn)同，并已成為動物實(shí)驗(yàn)研究中的重要內(nèi)容。有文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道動物福利水平高低會對實(shí)驗(yàn)動物的狀態(tài)產(chǎn)生影響，而動物實(shí)驗(yàn)中的抓取、穿刺、手術(shù)等操作和藥物作用引起的不適、疼痛以及環(huán)境壓力等都是福利損傷因素，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物福利水平的下降，進(jìn)而使動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差。因此，許多科研工作者在這些方面進(jìn)行了廣泛而深入研究，并取得了一定成果。但采血、手術(shù)或束縛等直接刺激所導(dǎo)致的福利損傷只是動物福利的一個(gè)方面，心理健康也是實(shí)驗(yàn)動物福利的重要組成部分，身心健康的實(shí)驗(yàn)動物才是“康樂”動物，才是真正標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動物[4]。心理刺激往往通過感官刺激、動物間的信息交流等形式產(chǎn)生，負(fù)面刺激會使實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生心理應(yīng)激，心理福利受損。心理應(yīng)激的動物其福利水平發(fā)生了什么變化，整體福利狀況如何，關(guān)于此方面報(bào)道較為罕見。本文以SD大鼠為對象，觀測承受一定時(shí)間的負(fù)面感官刺激及群體交流后，大鼠各項(xiàng)福利相關(guān)指標(biāo)的變化，探討心理健康對實(shí)驗(yàn)動物整體福利水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼育環(huán)境

8周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～200 g，由中國人民解放軍南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供[SCXK(軍)2012-0014]，屏障環(huán)境[SYXK(軍)2012-0047]飼養(yǎng)。60Co滅菌全價(jià)顆粒飼料與高溫高壓滅菌飲用水，自由采食。

1.2 主要儀器與試劑

動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(#Etho Vision XT，Noldus Information Technology，荷蘭)，冰凍離心機(jī)(#Neofuge 15R，Heal Force，中國香港)，PCR儀(#Step One Plus，Applied Biosystems，美國)，PCR引物(Invitrogen Biotechnology, 美國), 熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(LightCyclery 96, Roche, 瑞士), 多軌電生理儀(#Omniplex，Plexon, 中國), Trizol Reagent(#15596-026, Thermo, 美國), 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#K1622,Thermo, 美國), ELISA試劑盒(Sigma-Aldrich, 美國),免疫組織化學(xué)試劑盒(Sigma-Aldrich, 美國), 組織切片掃描儀(#Pannoramic MIDI, 3D Histech, 匈牙利),組織切片分析軟件(Pannoramic viewer、Quant center, 3D Histech, 匈牙利), 其他檢測相關(guān)試劑、耗材及器材均由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠隨機(jī)分為3籠, 編號1～3, 每籠10只大鼠, 編號1～10。其中電擊組: 1號籠和2號籠的1～5號大鼠為電擊組，共計(jì)10只; 實(shí)驗(yàn)組(T組): 1號籠和2號籠的6～10號大鼠為實(shí)驗(yàn)組，共計(jì)10只; 對照組(C組): 3號籠10只大鼠為對照組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)[5]方法: 電擊組大鼠每日9∶30～10∶00給予足部電擊, 每5 min 1次, 共30 min。電擊組大鼠僅作為應(yīng)激源，不計(jì)入最終實(shí)驗(yàn)處理; 實(shí)驗(yàn)組大鼠與電擊組大鼠同籠飼養(yǎng)，進(jìn)行電擊時(shí)不接受電擊但近距離旁觀電擊過程，接受感官刺激; 對照組大鼠正常飼養(yǎng)，電擊時(shí)隔離，不接受電擊產(chǎn)生的任何刺激。實(shí)驗(yàn)干預(yù)共計(jì)14 d, 次日行曠場實(shí)驗(yàn)[6,7]后處死大鼠，采取樣本用于指標(biāo)檢測。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 曠場實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過程中觀察并記錄實(shí)驗(yàn)組大鼠日常表現(xiàn)。曠場為不透明材料制成的箱式容器,尺寸為50 cm×50 cm×30 cm, 箱底劃分為等面積的25個(gè)正方形方格，四周有高30 cm的黑色周壁,無頂。實(shí)驗(yàn)時(shí)光照設(shè)置為黑夜模式，背景噪音控制在65 dB以下, 從同一位置將大鼠放入中央格, 采用動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄每只大鼠10 min內(nèi)的行進(jìn)總路程、平均速度、中央活動路程及中央活動時(shí)間。每檢測1只大鼠后使用酒精清理實(shí)驗(yàn)箱,避免遺留糞便、氣味等影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 體質(zhì)量與血壓指標(biāo)測定 記錄實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量變化, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算體質(zhì)量增加: 實(shí)驗(yàn)期間每間隔5 d使用多軌電生理儀(尾部無創(chuàng))監(jiān)測1次血壓，記錄收縮壓數(shù)據(jù)，每只大鼠每次測量3個(gè)數(shù)據(jù)，取平均值。

1.5.3 部分免疫學(xué)及內(nèi)分泌指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束尾靜脈采集各組大鼠血液樣本，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腎上腺素(EPI)、去甲腎上腺素(NE)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)水平; 采集各組大鼠胸腺和脾臟樣本，計(jì)算臟器系數(shù)。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝細(xì)胞核因子-κB(NF-κB) p65 mRNA相對含量 取大鼠肝臟組織，充分裂解后按Trizol操作說明提取總RNA。而后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作, 反轉(zhuǎn)錄cDNA, 反轉(zhuǎn)錄體系為 20 μL，每管加入總 RNA 4 μg, 37 ℃反應(yīng) 1 h，70 ℃ 15 min。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于RT-PCR反應(yīng)，引物為:

p65 上游引物5'- AAGCACAGATACCACCAAGACAC- 3'下游引物5'- CGCACTGCATTCAAGTCATAGTC - 3'擴(kuò)增片段長度324 bp，退火溫度60 ℃;

GAPDH上游引物5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA- 3'下游引物5'- GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC - 3'擴(kuò)增片段長度287 bp，退火溫度60 ℃。

反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，Cdna 2 μL, 上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，加入 Nuclease-Free Water至 20 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性 3 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)× 40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。將對照組大鼠基因表達(dá)水平定為1，比較實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)差異。

1.5.5 免疫組織化學(xué)檢測大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá) 取大鼠肝臟組織, 石蠟包埋、切片, SP法檢測, 嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明操作, 染色后由組織切片掃描儀進(jìn)行掃描、分析。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[8,9], 使用組織化學(xué)評分(H-score)分析方式對染色比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分, 其評分公式為H-score=∑(PI×I)。其中I代表染色強(qiáng)度，分別為0(藍(lán)色, 即未著色)、1(淺黃色)、2(深黃色)、3(棕色), PI代表不同染色強(qiáng)度的比例, 為0～100%。每張切片取5個(gè)×400鏡下視野進(jìn)行評分, 取平均值作為最終評分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均采用±s表示，組間差異比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 日常行為觀察及行為學(xué)指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)旁觀電擊后主要表現(xiàn)為驚恐，頻繁出現(xiàn)挖掘墊料鉆入等躲避行為; 當(dāng)電擊進(jìn)行到第5日左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠開始表現(xiàn)出敏感、高度警覺、易怒，被觸碰背部時(shí)豎毛、轉(zhuǎn)頭, 攻擊性增強(qiáng), 抓取時(shí)掙扎劇烈; 實(shí)驗(yàn)后期，實(shí)驗(yàn)組大鼠抗拒情緒減弱，攻擊性、反應(yīng)性降低，主要表現(xiàn)為蜷臥，雙眼無神，毛色雜亂無光澤。對照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間表現(xiàn)正常。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)組大鼠在曠場中的移動路程與對照組大鼠相比顯著降低(P＜0.05)，在曠場中部的活動路程及停留時(shí)間顯著增加(P＜0.05)。

2.2 體質(zhì)量增加及血壓指標(biāo)比較

與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的體質(zhì)量增加顯著降低(P＜0.05)(表2)。實(shí)驗(yàn)組大鼠的收縮壓指標(biāo)于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第5日后檢測時(shí)已出現(xiàn)較為明顯的上升, 但尚未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。隨著干預(yù)天數(shù)的增加, 實(shí)驗(yàn)第10日和第15日檢測時(shí), 實(shí)驗(yàn)組大鼠的血壓數(shù)據(jù)進(jìn)一步升高, 與對照組大鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

2.3 NF-κB 表達(dá)比較

2.3.1 NF-κB p65 mRNA表達(dá)比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的基因NF-κB p65和內(nèi)參GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，引物擴(kuò)增效率為99.8%。將對照組大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)水平定為1，實(shí)驗(yàn)組大鼠的基因表達(dá)量約為對照組的5.45倍(P＜0.05)。

2.3.2 NF-κB p65 蛋白表達(dá)比較 蛋白表達(dá)通過免疫組化檢測, 使用H-score評分(0～300)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示, 對照組大鼠H-scores平均得分2.53±0.47, 實(shí)驗(yàn)組大鼠平均得分43.95±3.66(P＜0.01)。

2.4 部分免疫及內(nèi)分泌指標(biāo)比較

2.4.1 各組大鼠的部分免疫學(xué)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組大鼠的主要免疫器官系數(shù)均出現(xiàn)一定程度的下降，但與對照組大鼠相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而血清IL-2的水平則顯著低于對照組(P＜0.05)(表3)。

2.4.2 各組大鼠的部分內(nèi)分泌指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組大鼠的EPI和NE水平均高于對照組, 且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清ACTH和CORT水平與對照組相比也都出現(xiàn)顯著的升高(P＜0.05)(表 4)。

3 討論

應(yīng)激是生物機(jī)體在對生存環(huán)境中多種不利因素的適應(yīng)過程中，實(shí)際的或者認(rèn)知上的要求與現(xiàn)實(shí)適應(yīng)能力兩者之間的不平衡而導(dǎo)致的身心緊張狀態(tài)及反應(yīng)[10]。多種應(yīng)激因素均可以對生物機(jī)體產(chǎn)生廣泛而嚴(yán)重影響，導(dǎo)致不僅是生理，同時(shí)還有心理功能紊亂的應(yīng)激損傷[11]。本研究選擇了電擊旁觀這一經(jīng)典方式進(jìn)行單一干預(yù)，給予大鼠心理刺激，以對其心理健康造成影響，同時(shí)盡量減少對大鼠軀體的直接物理刺激。通過實(shí)驗(yàn)觀察表明，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第5日左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠表現(xiàn)出驚恐，易怒等狀態(tài)，表明其受到了心理應(yīng)激，并迅速進(jìn)入了應(yīng)激抵抗期，其豎毛，攻擊性上升等表現(xiàn)都是對于外界刺激的一種防御性行為，時(shí)刻準(zhǔn)備應(yīng)對突發(fā)情況。隨著干預(yù)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組大鼠的主要表現(xiàn)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殪o臥, 精神萎靡, 被觸碰時(shí)逃避、豎毛、轉(zhuǎn)頭等行為基本消失, 表明大鼠的應(yīng)激反應(yīng)已由抵抗轉(zhuǎn)入衰竭，不能正常的應(yīng)對外界刺激, 反應(yīng)性下降，存在一定的應(yīng)激障礙。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)組大鼠在曠場中行動速度降低, 路程減少, 于中部區(qū)域停留時(shí)間長，表明實(shí)驗(yàn)組大鼠怠動, 對外界反應(yīng)靈敏性降低，探索行為減少, 活動性下降。

表1 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 各組大鼠體質(zhì)量增加和血壓結(jié)果

表3 各組大鼠部分免疫指標(biāo)結(jié)果

表4 各組大鼠部分內(nèi)分泌指標(biāo)結(jié)果

藍(lán)斑-腎上腺髓質(zhì)(LC/NE)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)是生物機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的兩條主要途徑。其中LC/NE系統(tǒng)主要參與應(yīng)激時(shí)的急性反應(yīng)，但該系統(tǒng)的持續(xù)興奮可引起明顯的組織分解和能量消耗, 以及部分器官的缺血甚至壞死[12]。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠血清EPI水平顯著升高，提示該系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，可以使軀干肌肉充血，保證軀體的運(yùn)動機(jī)能以應(yīng)對危機(jī)。但消化系統(tǒng)平滑肌群的長期缺血會導(dǎo)致大鼠食欲下降, 攝食減少，再加上高EPI水平引起的強(qiáng)烈分解作用，必然使大鼠的生長、發(fā)育水平受到影響。這剛好與本文實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓水平顯著高于對照組，體質(zhì)量增加顯著低于對照組的結(jié)果相印證，表明實(shí)驗(yàn)組大鼠LC/NE系統(tǒng)確實(shí)處于過度激活狀態(tài)，已對大鼠的機(jī)體造成影響，損害了其福利水平。HPA軸是生物機(jī)體應(yīng)對刺激的主要應(yīng)激通路，其激活的主要表現(xiàn)為外周血ACTH和CORT水平顯著升高。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠ACTH和CORT指標(biāo)均顯著高于對照組，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠由于長時(shí)間心理應(yīng)激導(dǎo)致HPA軸過度激活，使CORT的負(fù)反饋功能受到抑制甚至消失，外周血CORT水平持續(xù)上升。長時(shí)間的高CORT水平將改變機(jī)體的應(yīng)激行為、內(nèi)分泌及免疫活動，對機(jī)體產(chǎn)生不利影響[13,14]。IL-2是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，同時(shí)具有重要的中樞調(diào)節(jié)作用[15,16]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠的IL-2水平顯著降低也極有可能是由于長時(shí)間的高CORT水平引起的免疫抑制作用，使其免疫功能受到了負(fù)面影響。

近年來，一些研究者嘗試將應(yīng)激蛋白引入實(shí)驗(yàn)動物福利研究中，比如熱休克蛋白以及本文提及的NF-κB等。NF-κB調(diào)控范圍廣泛，同時(shí)能夠引起其活化的因素也有多種，應(yīng)激也是其中一種重要因素[17,18]。本次實(shí)驗(yàn)中, 對照組大鼠的NF-κB蛋白H-scores評分為2.53±0.47, 僅本底表達(dá), 而實(shí)驗(yàn)組大鼠的評分顯示其NF-κB表達(dá)水平顯著提升。雖然影響NF-κB的因素眾多, 但本實(shí)驗(yàn)中飼養(yǎng)條件均一,實(shí)驗(yàn)干預(yù)相對固定, 可以確定心理應(yīng)激就是引起實(shí)驗(yàn)組大鼠NF-κB表達(dá)水平上調(diào)的唯一原因?？紤]由于干預(yù)方式單一, 干預(yù)時(shí)間也較短，所以NF-κB表達(dá)水平僅低度上調(diào)，如果干預(yù)方式更為激烈并增加干預(yù)時(shí)間，預(yù)計(jì)NF-κB極可能表現(xiàn)出更為劇烈的變化。由此可見，旁觀電擊的負(fù)面感官刺激和社群交流作為應(yīng)激源導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)組大鼠心理應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生，同時(shí)導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)組大鼠NF-κB p65的mRNA水平上升，蛋白表達(dá)上調(diào)，并伴隨其他福利相關(guān)指標(biāo)的變化。該結(jié)果提示NF-κB與實(shí)驗(yàn)動物福利水平之間具有一定關(guān)聯(lián)，但其表達(dá)變化與其他福利相關(guān)指標(biāo)(如IL-2、ACTH以及CORT等)變化之間是否存在相關(guān)性，尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

許多科研人員在實(shí)驗(yàn)中都能夠注意到目標(biāo)動物的福利問題，但往往卻忽視了實(shí)驗(yàn)過程對其他動物的負(fù)面感官刺激。綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明負(fù)面感官刺激可導(dǎo)致大鼠的心理應(yīng)激，心理福利受損，整體福利水平下降，主要表現(xiàn)為：大鼠外觀萎靡，毛色差，凍結(jié)行為增加，對外界刺激敏感性降低；應(yīng)激蛋白NF-κB表達(dá)水平上調(diào)，大鼠機(jī)體長時(shí)間處于應(yīng)激狀態(tài); 食欲下降，生長受限，體質(zhì)量增加顯著減少; 主要免疫器官有萎縮趨勢，IL-2指標(biāo)顯著降低，整體細(xì)胞免疫水平下降，呈現(xiàn)一定程度的免疫抑制，機(jī)體疾病易感性上升; 外周血CORT、EPI等多項(xiàng)指標(biāo)出現(xiàn)顯著變化，并伴隨自主反饋機(jī)制失靈，呈現(xiàn)一定程度的內(nèi)分泌紊亂。在動物實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)重視負(fù)面感官刺激造成的應(yīng)激，實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)注意隔離, 盡量降低此類刺激對實(shí)驗(yàn)過程的影響, 以免造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差[19]。

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