周海鳳, 樂心逸, 王嫻嫻, 丁廣宇, 李默影, 沈龍海, 吳 彤

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海 200437)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性、進(jìn)行性炎癥損傷為特征, 臨床表現(xiàn)為慢性、自殘性自身免疫性疾病[1]。佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)由細(xì)菌學(xué)家Freund于20世紀(jì)50年代創(chuàng)立, 又稱弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎, 是免疫性動物模型的基礎(chǔ)方法[2]。炎癥以踝關(guān)節(jié)為重, 可侵及足墊、全足[3]。AA的發(fā)病原理與RA相似，為一種典型的免疫性炎癥反應(yīng)，且AA大鼠造模的方法簡單易行，其病理表現(xiàn)與RA臨床反應(yīng)類似，故在我國被廣泛用于RA或防治RA藥物的研究。II型膠原是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白, 有報(bào)道[4]證明50%的RA患者血清中存在有抗II型膠原的自身抗體, 證明了II型膠原能誘發(fā)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA), CIA模型是目前作為抗RA藥物研究中被認(rèn)為最接近人類RA的實(shí)驗(yàn)動物模型。

刺山柑(Capparis spinosaL.)屬白花菜科(capparidaceae)山柑屬(capparis)植物，其原產(chǎn)于地中海地區(qū)，后被廣泛種于亞洲西部和中部地區(qū)[5]。其未成熟的花蕾、果實(shí)和芽被作為烹飪中的食物或調(diào)味品食用。該植物的不同部分, 包括花蕾、果實(shí)、種子、莖、根和皮, 作為民族藥被用于各種疾病的治療，如風(fēng)濕、胃痛、頭痛、牙痛等[6]。我國維吾爾族民間用于治療風(fēng)濕病, 有祛風(fēng)、散寒、除濕的作用[7]。研究[8]表明刺山柑活性部位中主要含有三類化學(xué)成分: 吲哚類、黃酮類、酚酸類化合物。其中雙黃酮類化合物具有很好的NF-κB抑制活性[9]。本文開展了刺山柑精制提取物在佐劑和II型膠原兩種致炎劑誘導(dǎo)的RA模型中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示刺山柑精制提取物具有預(yù)防和治療RA疾病的開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

AA造模，采用清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20) g; CIA造模: 采用對膠原免疫反應(yīng)更為敏感的清潔級雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(130±10) g; 以上大鼠均購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[SCXK(滬)2008-0016]; 飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(滬)2014-40018], 溫度 24～26℃, 相對濕度 60%～70%，自由飲食飲水。

1.2 受試藥物

刺山柑精制提取物主要由刺山柑藥材(產(chǎn)地: 吐魯番)使用回流法煎制濃縮的浸膏采用水提醇沉和乙酸乙酯萃取法精制而成，制備法參考專利文獻(xiàn)[10],得率為1.14‰，批號20151003。陽性藥使用臨床常用藥吲哚美辛腸溶片(上海信誼黃河制藥有限公司批號: A100101)。

1.3 儀器與試劑

弗氏完全佐劑(Freunds Adjuvand in Complete)，購自荷蘭Difco公司, 批號: 23553464; II型膠原(CII,牛軟骨中提取) 購自美國Sigma公司, 編號: C7806-160 mg 035k3748 CAS 9007-34-5; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 -1(IL-1)和干擾素 -γ(IFN-γ)檢測試劑盒均購自上海欲立生物科技有限公司。YLS-7A 足趾容積測量儀，購自荷蘭Herga Electric公司; Varioskan Flash 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 刺山柑提取物治療大鼠AA 30只大鼠取其中24只隨機(jī)分4組，每組6只，以弗氏完全佐劑(10 mg/kg) 0.1 mL右后足跖皮下注射致炎, 剩余大鼠麻醉處死后取關(guān)節(jié)滑膜冷凍備用。造模大鼠造模前和造模后15 d內(nèi)每3 d以足趾容積測量儀用排水法測量致炎足及未致炎足的足墊體積, 觀察造模是否成功。確定造模成功后從15 d起連續(xù)給藥10 d, 其中刺山柑提取物低劑量組100 mg/kg、刺山柑提取物高劑量組200 mg/kg、吲哚美辛陽性藥組2 mg/kg。記錄致炎和給藥前后的大鼠足墊腫脹體積, 其中腫脹度 =(致炎后體積/致炎前體積-1)×100%, 抑制率 =(1-給藥組腫脹率/模型組腫脹率) × 100%, 計(jì)算腫脹度和抑制率。給藥結(jié)束(致炎后25 d), 處死動物,取所有大鼠踝關(guān)節(jié)周圍組織制備勻漿液, 測定組織液中TNF-α、IL-1、IFN-γ水平的變化, 該操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 刺山柑提取物治療II型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 致炎劑配置: II型膠原溶解在0.05 mol/L醋酸中，配置成終濃度為2 g/L膠原溶液, 4 ℃過夜，次日將II型膠原溶液滴加至冷的弗氏完全佐劑中, 充分乳化(II型膠原液: 弗氏完全佐劑=1∶1)，使終濃度為1g/L II型膠原乳劑。

分組和給藥: 40只大鼠取5只為正常對照組，其余35只大鼠分5點(diǎn)皮內(nèi)注射免疫(尾部及背皮內(nèi)四點(diǎn))，每點(diǎn)0.1 mL，共0.5 mL含有II型膠原量為0.5 mg，7 d后以同樣方法追加免疫一次。在造模20 d選取足關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹, 足背面也開始紅腫的成功致敏大鼠15只，隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為模型組[給予相應(yīng)溶劑(生理鹽水)]、刺山柑提取物組(50 mg/kg)、陽性藥組(吲哚美辛2 mg/kg)。以上大鼠每日灌胃給藥1次, 持續(xù)14 d(劑量為50 mg/kg)，造模成功后(20 d起)每周2次以足趾容積測量儀用排水法測量大鼠足關(guān)節(jié)腫脹值，計(jì)算腫脹率及抑制率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理, 以±s表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺山柑提取物對大鼠AA治療作用

造模過程中各組動物造模趾在致炎3 d內(nèi)腫脹值迅速升高, 在9～12 d達(dá)到高峰, 由表1可見, 造模15 d與0 d相比大鼠致炎側(cè)足體積有差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。此時(shí)與正常大鼠比較, 可見造模大鼠的耳廓、尾部、前肢均出現(xiàn)了明顯的紅腫,前肢的足跖有明顯的小關(guān)節(jié)突出。造模過程中大鼠日常行為出現(xiàn)明顯的行動困難，致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)下全部足爪腫脹, 部分大鼠在15 d時(shí)未注射佐劑一側(cè)(對側(cè)非致炎足)因遲發(fā)性病變部分出現(xiàn)足墊腫脹，各組大鼠在同一時(shí)間組間腫脹度比較無顯著差異。

表1數(shù)據(jù)顯示, 刺山柑提取物對大鼠AA繼發(fā)性病變具有一定的治療作用, 其中刺山柑低劑量組在20～27 d與模型相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),抑制率分別為12.4%、14.7%、16.2%，抑制率呈現(xiàn)上升趨勢; 刺山柑高劑量組在連續(xù)給藥3 d后與模型對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)并一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 抑制率最高可達(dá)到26.8%。刺山柑不同劑量組與陽性藥組相比抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示刺山柑提取物有部分抗炎效果。

由表2可見，與正常對照大鼠比較，模型組大鼠的血清中TNF-α，IL-1，IFN-γ的含量與均有極顯著上升(P＜0.01), 提示造模成功，不同劑量給藥組與模型組相比均能顯著降低大鼠血清中TNF-α和IL-1的含量(P＜0.05)，其中刺山柑提取物低劑量、高劑量均能極顯著下調(diào)IFN-γ含量(P＜0.01)，刺山柑不同劑量組與陽性藥組相比治療效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示了刺山柑提取物可通過調(diào)節(jié)對TNF-α，IL-1，IFN-γ的表達(dá)而起到抗炎作用。

2.2 刺山柑提取物對大鼠CIA的治療作用

致炎過程中大鼠體質(zhì)量無明顯增長、精神萎靡、尾尖部出現(xiàn)潰爛灶，背部注射部位也都有潰爛灶，造模18 d部分大鼠足關(guān)節(jié)開始紅腫，20 d大鼠的足關(guān)節(jié)已明顯紅腫，部分大鼠對惻足和前爪也出現(xiàn)紅腫，造模成功率約50%。給藥的前3 d無明顯作用，一周后各給藥組開始出現(xiàn)不同程度的足關(guān)節(jié)的腫脹抑制作用，外觀可見大鼠足趾紅腫逐漸消退，活動趨向正常，而模型組動物足關(guān)節(jié)依然腫脹、紅腫，行動不便，有的雙肢癱瘓，消瘦、萎靡，體質(zhì)量減輕，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如表3所示, 刺山柑提取物在給藥后3 d, 開始出現(xiàn)一定程度的抑制足關(guān)節(jié)的腫脹，致炎后27 d、30 d、34 d與模型組比較的抑制率分別為33.8%、47.2%、40.3%, 差異有一定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示刺山柑提取物存在抑制特異性免疫，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

3 討論

刺山柑的果實(shí)、葉、花和根皮在維吾爾族民間均可作為治療類風(fēng)關(guān)藥物使用, 根皮應(yīng)用最廣; 常用方法為敷于患處和口服[11]。文獻(xiàn)多報(bào)道刺山柑果實(shí)、花、根皮的粗提物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[12]、降糖[13]、利尿、抗高血壓、外敷治療關(guān)節(jié)炎等[14]。本文首次采用刺山柑果實(shí)的精制提取物[10]為研究對象, 并通過弗氏完全佐劑和II型膠原兩種致炎劑建立的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型評價(jià)其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)的藥效作用，同時(shí)考察了其可能的作用機(jī)制。

表1 刺山柑提取物對AA大鼠致炎側(cè)的治療作用

表2 刺山柑提取物對AA大鼠血清內(nèi)炎癥因子的影響

表3 刺山柑提取物對CIA大鼠致炎側(cè)的治療作用

研究結(jié)果表明，刺山柑精制提取物對大鼠AA繼發(fā)性病變具有一定的治療作用，其中刺山柑低劑量(100 mg/kg)組給藥一周后與模型組比有顯著差異(P＜0.05), 抑制率分別為12.4%、14.7%、16.2%, 抑制率呈現(xiàn)上升趨勢; 刺山柑高劑量(200 mg/kg)組在連續(xù)給藥3 d后與模型對照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 該顯著差異一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，高劑量的抑制率基本穩(wěn)定在20%以上; 同時(shí)刺山柑提取物能通過調(diào)節(jié)對TNF-α, IL-1, IFN-γ的表達(dá)而起到抗炎作用。

刺山柑提取物對CIA同樣有效，從給藥3 d起開始起效, 致炎27 d、30 d、34 d與模型組比較抑制率分別為33.8%、47.2%、40.3%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為刺山柑果實(shí)提取物進(jìn)一步開發(fā)為抗RA疾病的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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