馬劍鋒，張艷彩，孫慧

鄭州市第七人民醫(yī)院1普外科，2實(shí)驗(yàn)室，鄭州4500003河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州450000

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近些年該病在中國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段的復(fù)雜過(guò)程，已有大量研究表明抑癌基因失活、癌基因激活影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，研究乳腺癌中抑癌基因及癌基因的表達(dá)情況，并研究其作用機(jī)制，對(duì)于乳腺癌的臨床及分子靶向治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，小分子糖蛋白絲甘蛋白聚糖（serglycin，SRGN）的表達(dá)與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，SRGN可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制SRGN的表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[2-3]，但關(guān)于SRGN對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚未清楚。因此，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞中SRGN的表達(dá)，旨在研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，并研究其可能的分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569均購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙錠（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2（phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2）、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于水浴鍋中，37℃解凍后，加入RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)SRGN蛋白的表達(dá)水平取出培養(yǎng)瓶中融合度超過(guò)90%的細(xì)胞，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，于培養(yǎng)皿中每106個(gè)細(xì)胞加入裂解液100 μ（lRIPA∶PMSF=100∶1），冰上裂解30 min，離心，上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，每孔道加入總蛋白50 μg，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），電泳的初始電壓為60 V，30 min后將電壓調(diào)整至110 V，于溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣1 cm時(shí)結(jié)束電泳，整個(gè)過(guò)程約2 h。電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）后，采用5%的脫脂奶粉封閉過(guò)夜，置于水平搖床中，4℃孵育一抗過(guò)夜，SRGN及內(nèi)參GAPDH抗體分別按照1∶500和1∶1000稀釋，洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10000稀釋），置于水平搖床中，室溫下孵育1 h，洗膜，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀上進(jìn)行拍照分析。

1.2.3SRGNsiRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將SRGNsiRNA（siRNA-SRGN組）及陰性對(duì)照siRNA-Con（siRNA-Con組）經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞，僅加入脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組，培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中SRGN蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，加入結(jié)合緩沖液 500 μl懸浮細(xì)胞，避光，于冰上加入 5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI稀釋液，充分混勻后避光室溫培養(yǎng)10 min，再加入冷卻的400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察并比較各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 凋亡蛋白及JAK/STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 凋亡蛋白cleaved caspase 3及JAK/STAT信號(hào)通路蛋白p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平的檢測(cè)參照1.2.2方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRGN蛋白在乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表達(dá)水平分別為（0.096±0.011）、（0.526±0.057）、（0.312±0.038）、（0.488±0.052）、（0.301±0.029），5 種細(xì)胞中SRGN蛋白的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.043，P＜0.01）。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、SMMC-7721、MCF7、HCC1569中SRGN蛋白的表達(dá)水平均高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 SRGN在乳腺癌細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中SRGN蛋白表達(dá)水平的影響

SRGNsiRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、siRNACon組和siRNA-SRGN組中SRGN蛋白的表達(dá)水平分別為（0.337±0.042）、（0.316±0.040）、（0.087±0.010），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.963，P＜0.01）。siRNA-SRGN組的SRGN蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），siRNA-Con組和空白對(duì)照組的SRGN蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中SRGN蛋白表達(dá)水平的影響

2.3 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照組、siRNA-Con組和siRNA-SRGN組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.20±0.32）%、（2.28±0.38）%、（11.16±1.22）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=137.571，P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，siRNA-SRGN組的細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2.4 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)凋亡蛋白及JAK/STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

空白對(duì)照組、siRNA-Con組和siRNA-SRGN組的cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平分別為（0.037±0.007）、（0.048±0.008）、（0.125±0.012），p-JAK2蛋白表達(dá)水平分別為（0.189±0.020）、（0.192±0.022）、（0.044±0.010），p-STAT3蛋白表達(dá)水平分別為（0.147±0.013）、（0.156±0.015）、（0.028±0.006），3組的cleaved caspase 3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F1=80.510、F2=65.454、F3=106.835，P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，siRNA-SRGN組的cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平升高，p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖4）

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)染SRGN siRNA對(duì)凋亡蛋白及JAK/STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

近年來(lái)乳腺癌基因的研究成為熱點(diǎn)，已有多個(gè)分子標(biāo)志物應(yīng)用于乳腺癌的臨床診斷及治療，但仍需發(fā)現(xiàn)更多的基因治療靶點(diǎn)。SRGN屬于小分子蛋白聚糖家族中的一員，可存在于細(xì)胞內(nèi)，也可存在于細(xì)胞外，主要在內(nèi)皮細(xì)胞、一些腫瘤細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞中表達(dá)[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，SRGN的表達(dá)與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，鼻咽癌細(xì)胞中SRGN的表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣改變[7]；SRGN在急性髓系白血病中的表達(dá)升高與腫瘤形成有關(guān)[8]；乳腺癌細(xì)胞中SRGN的表達(dá)升高，可提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力[2-3]，然而SRGN對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響尚未清楚。

本研究采用Western blot檢測(cè)正常乳腺上皮細(xì)胞和不同乳腺癌細(xì)胞中SRGN蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中SRGN蛋白的表達(dá)水平高于正常乳腺上皮細(xì)胞，由于SRGN在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)水平最高，因此被選擇作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。RNA干擾技術(shù)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可使基因在轉(zhuǎn)染后發(fā)生沉默的技術(shù)，具有特異性和高效性，在腫瘤治療及基因功能研究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9-10]。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默MDA-MB-231細(xì)胞中SRGN的表達(dá)，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制SRGN的表達(dá)可使MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率升高。細(xì)胞凋亡受到Caspases家族影響，caspase 3是Caspases家族中的關(guān)鍵酶，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，生理?xiàng)l件下caspase 3以無(wú)活性的酶原形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞及組織中存在，當(dāng)有凋亡刺激時(shí)被活化，活化的caspase 3可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的不可逆[11-12]。目前caspase 3已作為包括乳腺癌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡的檢測(cè)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，SRGN表達(dá)受抑制后cleaved caspase 3的表達(dá)升高，提示SRGN促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)上調(diào)cleaved caspase 3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、分化及免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程，在多種腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài)[15-16]。有研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的增殖及凋亡具有重要作用，抑制該信號(hào)通路可抑制癌細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制SRGN的表達(dá)可抑制JAK/STAT信號(hào)通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)，提示SRGN可正向調(diào)控JAK/STAT信號(hào)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SRGN在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)升高，通過(guò)RNA干擾抑制其表達(dá)后可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式是上調(diào)cleaved caspase 3的表達(dá)。本研究為深入探討乳腺癌的發(fā)病機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)，提示SRGN可能成為乳腺癌的分子診斷及治療靶點(diǎn)。但本研究?jī)?nèi)容有限，且未在體內(nèi)試驗(yàn)中驗(yàn)證，因此尚需進(jìn)一步研究。

[1]Neophytou CM,Constantinou C,Papageorgis P,et al.D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate(TPGS)induces cell cycle arrest and apoptosis selectively in Survivinoverexpressing breast cancer cells[J].Biochem Pharmacol,2014,89(1):31-42.

[2]Roy A,Femel J,Huijbers EJ,et al.Targeting serglycin prevents metastasis in murine mammary carcinoma[J].PLoS One,2016,11(5):e0156151.

[3]張志杰,鄧印根,尹江,等.miR-181b/c靶向調(diào)控SRGN抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2014,16(9):1164-1167;1171.

[4]Reine TM,Vuong TT,Jenssen TG,et al.Serglycin secretion is part of the inflammatory response in activated primary human endothelial cells in vitro[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(8):2498-2505.

[5]Roy A,Attarha S,Weishaupt H,et al.Serglycin as a potential biomarker for glioma:association of serglycin expression,extent of mast cell recruitment and glioblastoma progression[J].Oncotarget,2017,8(15):24815-24827.

[6]Purushothaman A,Bandari SK,Chandrashekar DS,et al.Chondroitin sulfate proteoglycan serglycin influences protein cargo loading and functions of tumor-derived exosomes[J].Oncotarget,2017,8(43):73723-737732.

[7]Chia CS,Ong WS,Li XJ,et al.Serglycin expression:an independent marker of distant metastases in nasopharyngeal carcinoma[J].Head Neck,2016,38(1):21-28.

[8]Purushothaman A,Toole BP.Serglycin proteoglycan is required for multiple myeloma cell adhesion,in vivo growth,and vascularization[J].J Biol Chem,2014,289(9):5499-5509.

[9]樊蓓,李紅霞,吳玉梅,等.小分子干擾RNA抑制TNC基因的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥[J].癌癥進(jìn)展,2017,15(7):749-753.

[10]Li-Byarlay H,Li Y,Stroud H,et al.RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(31):12750-12755.

[11]任吉祥,劉爽,孫洋,等.新型腫瘤抑素對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2016,36(19):4705-4706.

[12]Wu R,Tang S,Wang M,et al.MicroRNA-497 induces apoptosis and suppresses proliferation via the Bcl-2/Bax-Caspase9-Caspase3 pathway and cyclin D2 protein in HUVECs[J].PLoS One,2016,11(12):e0167052.

[13]Xie X,Hu Y,Xu L,et al.The role of miR-125b-mitochondria-caspase-3 pathway in doxorubicin resistance and therapy in human breast cancer[J].Tumour Biol,2015,36(9):7185-7194.

[14]劉寧,譚文成,夏吉生,等.miR-34a靶向MMP-13調(diào)控大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版),2016,37(2):139-145.

[15]Kowshik J,Baba AB,Giri H,et al.Astaxanthin inhibits JAK/STAT-3 signaling to abrogate cell proliferation,invasion and angiogenesis in a hamster model of oral cancer[J].PLoS One,2014,9(10):e109114.

[16]Hu Y,Hong Y,Xu Y J,et al.Inhibition of the JAK/STAT pathway with ruxolitinib overcomes cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer NSCLC[J].Apoptosis,2014,19(11):1627-1636.

[17]Slattery ML,Lundgreen A,Hines LM,et al.Genetic variation in the JAK/STAT/SOCS signaling pathway influences breast cancer-specific mortality through interaction with cigarette smoking and use of aspirin/NSAIDs:the Breast Cancer Health Disparities Study[J].Breast Cancer Res Treat,2014,147(1):145-158.