楊棟霞，馬桂霞

鄭州市第一人民醫(yī)院婦科，鄭州450004

宮頸癌是一種常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)有超過(guò)85%的宮頸癌患者發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家，治療失敗、復(fù)發(fā)率高等是宮頸癌致死的重要原因[2]。腫瘤細(xì)胞有著與正常細(xì)胞不同的能量代謝方式，盡管在氧氣充足的環(huán)境下仍然以糖酵解為主要代謝途徑，這種代謝方式能夠增加腫瘤細(xì)胞的耐受能力，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[3]。NOB1是一種鋅帶蛋白，能夠調(diào)控溶酶體的形成和成熟，在核糖體小亞基的合成中發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。NOB1與細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，在正常癌旁組織中表達(dá)水平明顯低于腫瘤組織[5]。有研究表明，NOB1下調(diào)后的骨肉瘤細(xì)胞、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖活力下降，細(xì)胞周期紊亂[6-7]。癌細(xì)胞的生長(zhǎng)需要糖酵解途徑提供能量，對(duì)于NOB1在宮頸癌細(xì)胞糖酵解及細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確。本研究主要探討NOB1在宮頸癌細(xì)胞糖酵解和凋亡中的作用，為靶向治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細(xì)胞HeLa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；NOB1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工合成；胰蛋白酶、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HK-Ⅱ）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔抗NOB1一抗、兔抗β-連環(huán)蛋白（β-catenin）一抗和兔抗c-myc一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；NOB1siRNA、siRNA control均購(gòu)自美國(guó)Roche公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

宮頸癌細(xì)胞用含有胎牛血清總體積10%和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。將保存在液氮中的細(xì)胞取出后，放置于溫度設(shè)定為37℃的水浴中，搖動(dòng)溶解。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6 cm的培養(yǎng)皿后，加入3 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。密度達(dá)到90%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min。1500 rpm離心3 min。棄上清，加入1 ml的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。用Lipofectamine 2000將NOB1siRNA、siRNA control轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞中，記為NOB1siRNA組、siRNA control組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每個(gè)6孔板每孔加入1 ml的Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，步驟參照瑞士羅氏的FastStart Universal SYBR Green MasterMix說(shuō)明書(shū)。NOB1-正義：5'-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3'，NOB1-反義：5'-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3'；GAPDH-正義：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，GAPDH-反義：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃，10 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)。運(yùn)用△△Ct法分析相對(duì)表達(dá)量：以GAPDH為內(nèi)參基因，取內(nèi)參和目的基因的Ct值的差值，△Ct=Ct目的－Ct內(nèi)參，△△Ct=（轉(zhuǎn)染組目的基因Ct值－轉(zhuǎn)染組內(nèi)參基因Ct值）－（對(duì)照組目的基因Ct值－對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

siRNA control組、NOB1siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入200 μl的結(jié)合緩沖液混合后，依次加入5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）和 5 μl膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）孵育反應(yīng)10 min。在細(xì)胞懸浮液中加入400 μl結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 HK-Ⅱ和LDH活性檢測(cè)

siRNA control組、NOB1siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，用HK-Ⅱ和LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中HK-Ⅱ和LDH水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 Western blot法檢測(cè)NOB 1、 β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)

siRNA control組、NOB1siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，按照蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。用12%分離膠、4%濃縮膠進(jìn)行電泳，80 V電壓跑膠30 min，將電壓加至120 V，直到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)入分離膠底部邊緣。300 mA轉(zhuǎn)膜90 min。用5%的胎牛血清白蛋白室溫?fù)u床封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。加入1000倍稀釋的一抗，4℃過(guò)夜反應(yīng)。TBST洗3次，每次5 min。與3000倍稀釋的二抗室溫反應(yīng)2 h。ECL發(fā)光，曝光，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟-件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOB 1蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

siRNA control組細(xì)胞中NOB1mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細(xì)胞中NOB1mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 Western blot法檢測(cè)NOB 1蛋白表達(dá)情況

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞中NOB 1表達(dá)水平的比較（ n= 3，±s）

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞中NOB 1表達(dá)水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值1.00±0.08 0.98±0.12 0.32±0.04*60.161 0.000 0.93±0.09 0.94±0.07 0.25±0.06*84.813 0.000 NOB1 mRNA NOB1蛋白

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為（12.04±1.14）%、（45.21±4.22）%、（11.25±1.36）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=161.337，P=0.000）；其中，siRNA control組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

2.3 HK-Ⅱ和LDH活性檢測(cè)結(jié)果

siRNA control組細(xì)胞HK-Ⅱ和LDH水平與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細(xì)胞HK-Ⅱ和LDH水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值HK-Ⅱ（×103U/g）165.37±14.23 158.54±16.35 89.66±10.70*27.014 0.001 LDH（×103U/g）3124.58±286.84 3018.86±256.73 1896.12±142.57*24.753 0.001

2.4 β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

siRNA control組細(xì)胞β-catenin和c-myc水平與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細(xì)胞β-catenin和c-myc水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖3、表3）

圖3 Western blot法檢測(cè)β -catenin和c-myc蛋白表達(dá)情況

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)水平的比較（ n= 3，±s）

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對(duì)照組細(xì)胞β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值β-catenin 1.15±0.11 1.18±0.13 0.32±0.04*70.069 0.000 c-myc 0.68±0.07 0.69±0.05 0.26±0.04*60.233 0.000

3 討論

NOB1蛋白最初在酵母雙雜交中被發(fā)現(xiàn)，參與核糖體RNA合成[8]。人NOB1基因含有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，位于16q22.1染色體上，其編碼的蛋白含有一個(gè)PIN結(jié)構(gòu)和一個(gè)ZNRD1結(jié)構(gòu)，在蛋白酶體合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。NOB1蛋白在卵巢癌組織中的mRNA表達(dá)水平高于正常的癌旁組織和良性腫瘤組織，而干擾NOB1表達(dá)后的卵巢癌細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞克隆形成能力明顯受到抑制[10]。張向民[11]通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)NOB1在前列腺癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOB1在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)。

細(xì)胞能量代謝能夠?qū)⒂袡C(jī)物轉(zhuǎn)化為能量，屬于新陳代謝中的一種。正常情況下，葡萄糖可以通過(guò)有氧氧化、糖酵解兩種途徑產(chǎn)生能量，當(dāng)細(xì)胞中氧氣充足時(shí)以有氧氧化為主，只有在氧氣不足的情況下才會(huì)通過(guò)糖酵解供能[12]。癌細(xì)胞有著與正常細(xì)胞不一樣的代謝方式，其無(wú)論是在氧氣充足還是氧氣不足的情況下均以糖酵解為主要方式，這種方式稱(chēng)為“Warburg效應(yīng)”[13]。HK作為糖酵解過(guò)程中的第一個(gè)限速酶，在腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。HK-Ⅱ是HK的一種亞型，是與腫瘤關(guān)系最為密切的HK[15]。LDH能夠?qū)⒈岽呋纬扇樗幔悄[瘤細(xì)胞糖酵解中的關(guān)鍵調(diào)控酶[16]。已經(jīng)有研究表明，HK-Ⅱ、LDH在結(jié)直腸癌等腫瘤中活性異常升高，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[17-18]。

王宇華等[19]發(fā)現(xiàn)，NOB1在宮頸癌患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為71%，而在宮頸炎患者中的表達(dá)水平只有7%。楊桂春等[20]發(fā)現(xiàn)NOB1在宮頸癌中的表達(dá)水平與患者的生存率、臨床資料等具有相關(guān)性，是一種潛在的用于宮頸癌治療和預(yù)后的癌基因。本研究結(jié)果顯示，NOB1下調(diào)后的宮頸癌細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中HK-Ⅱ、LDH活性降低，細(xì)胞糖酵解水平降低。本研究結(jié)果同樣說(shuō)明了NOB1是一種癌基因，并且進(jìn)一步表明了NOB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞糖酵解的調(diào)控作用。對(duì)于NOB1在其他宮頸癌細(xì)胞中的作用是否同本研究一樣需要進(jìn)一步探討。

Wnt/β-catenin是Wnt的經(jīng)典信號(hào)通路，不僅可以調(diào)控正常細(xì)胞的增殖，還與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)[21]。β-catenin 作為 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，在腫瘤中過(guò)度表達(dá)，c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，Wnt/βcatenin信號(hào)通路激活后促進(jìn)c-myc的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示，NOB1表達(dá)下調(diào)后的宮頸癌細(xì)胞中β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)下降，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活受到抑制，而對(duì)于其具體的調(diào)控機(jī)制仍然需要驗(yàn)證。

綜上所述，NOB1下調(diào)后宮頸癌細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞糖酵解途徑調(diào)控酶HK-Ⅱ、LDH活性降低，細(xì)胞糖酵解水平下降。NOB1是一種癌基因，其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為探討NOB1在宮頸癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為靶向NOB1治療宮頸癌提供了理論基礎(chǔ)。

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