張葆鑫，王興國，郝廷

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷一科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

間充質(zhì)干細(xì)胞屬于干細(xì)胞家族成員，屬于多功能干細(xì)胞，可用于組織器官損傷的修復(fù)，臨床具有較高的應(yīng)用價(jià)值，為此該院研究雪蓮花和單味中藥黃芪、淫羊藿、丹參以及復(fù)方右歸飲煎劑對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

藥材和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，藥材包括黃芪、淫羊藿、丹參和復(fù)方右歸飲，其中復(fù)方右歸飲中包括炒山藥、熟地、肉桂和制附子等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性成年大鼠，4月齡，體重 （220±16）g。 實(shí)驗(yàn)試劑包括淋巴細(xì)胞分離液，LDMEM、胰蛋白酶、酶標(biāo)儀、二甲基亞楓、四甲基偶氮唑鹽(MTT)以及戊巴比妥鈉。

1.2 方法

1.2.1 醇體液和煎劑配置 取90 g黃芪、27 g淫羊藿、45 g黃芪分別加入冷水浸泡50 min后用大火煮開，文火熬制1 h，最后得到60 mL溶液作為定容溶液，此濃度為大鼠服藥濃度的10倍。單味雪蓮花制備方法：取5.3 g雪蓮花一段，將其剪碎后浸泡在75%的乙醇中1個(gè)月，之后用紗布對其溶液進(jìn)行過濾，將溶液在74℃環(huán)境下進(jìn)行乙醇揮發(fā)，直到無明顯酒精味，定容體積為60 mL。復(fù)方右歸飲制備方法：取杜仲、炒山藥、熟地和枸杞各18 g，山茱萸、肉桂、炙甘草和制附子各9 g，使用冷水進(jìn)行浸泡40 min以后用大火煮開，文火熬制，定容體積為60 mL，其濃度為大鼠服藥濃度的10倍。將以上醇提液和中藥煎劑進(jìn)行高壓滅菌。

1.2.2 含藥血清配置 使用濃度為大鼠服藥濃度10倍的醇提液和中藥煎劑對大鼠進(jìn)行灌胃，每天進(jìn)行2次，每次8 h一次，連續(xù)實(shí)施3 d，在最后一天灌胃1 h后給予腹腔麻醉[2]，并采取心尖血，在2 500 r/min條件下離心25 min，4℃ 過夜，提取血清，使用0.22 μm濾膜抽濾并分裝，在56℃下滅火30 min,保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分離 原代細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，在細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)進(jìn)行消化傳代，將含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，使用PBS緩沖液沖洗2次，使用0.4%的胰蛋白酶3 mL進(jìn)行消化，持續(xù)時(shí)間為3～5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)開始變圓皺縮后，使用等量的完全培養(yǎng)液將消化停止，并制作成細(xì)胞懸液。按照1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.4 醇提液、中藥煎劑以及含藥血清干預(yù) 去濃度為2×105/mL的第3代干細(xì)胞接種在96孔板上，培養(yǎng)24 h，吸取上清之后，加入不含血清的DMEM溶液100 μL/孔，培養(yǎng)24 h后，將上去吸取后，加入含有15%的小牛血清液的DMEM 培養(yǎng)液100 μL/孔，然后將丹參、黃芪、雪蓮花、淫羊藿和雪蓮花醇提液加入進(jìn)去[4]，雪蓮花醇提液濃度梯度為（10-2、10-3、10-4，10-5），70 μL/孔藥液，每個(gè)濃度放置在5個(gè)孔內(nèi)，將上清液吸取之后加DMSO200 μL/孔，在10 min后通過酶標(biāo)儀測量OD值，波長顯示為492 nm。

1.2.5 檢測方法 使用MTT方法進(jìn)行檢測，觀察出活細(xì)胞的功能和數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

該次調(diào)查涉及數(shù)據(jù)均輸入SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，組間計(jì)量資料用（±s）表示，行 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

醇體液和煎劑的MTT檢測結(jié)果，丹參煎劑具有抑制細(xì)胞增殖的作用，在10-5和10-4濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,淫羊藿煎劑具有抑制細(xì)胞增殖的作用，在10-3和10-2濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,右歸飲煎劑、黃芪煎劑和蓮花醇提液在4個(gè)濃度組均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（P＜0.01），見表1。

表1 醇體液和煎劑的MTT檢測結(jié)果對比（±s）

表1 醇體液和煎劑的MTT檢測結(jié)果對比（±s）

藥物 例數(shù) 空白對照濃度組10-5 10-4 10-3 10-2黃芪丹參淫羊藿雪蓮花右歸飲5 5 5 5 5 0.073±0.002 0.193±0.012 0.138±0.014 0.061±0.001 0.065±0.022 0.142±0.016 0.115±0.011 0.137±0.026 0.139±0.020 0.192±0.022 0.119±0.020 0.135±0.014 0.134±0.025 0.184±0.020 0.169±0.012 0.144±0.017 0.175±0.021 0.119±0.006 0.184±0.020 0.186±0.036 0.176±0.014 0.177±0.015 0.138±0.014 0.061±0.001 0.172±0.038

3 討論

該次調(diào)查結(jié)果顯示黃芪煎劑和蓮花醇提液在4個(gè)濃度組均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。丹參具有安神寧心、活血化瘀的功效，并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，在該次研究中發(fā)現(xiàn)丹參煎劑具有抑制細(xì)胞增殖的作用，在10-5和10-4濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。淫羊藿煎劑具有抑制細(xì)胞增殖的作用，在10-3和10-2濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。雪蓮花中的有效成分為黃酮，其內(nèi)含有高豐前素，其能夠清除身體內(nèi)的自由基，改善微循環(huán)，改變血流動(dòng)力學(xué)，增加機(jī)體免疫力，具有抗疲勞的作用具有強(qiáng)壯筋骨、補(bǔ)腎壯陽的作用也比較明顯，右歸飲能夠促進(jìn)堿性磷酸酶的活性，使鈣沉積，促進(jìn)成骨的形成，同時(shí)也減少了鈣質(zhì)的流失，具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，能夠延緩軟骨細(xì)胞凋亡時(shí)間。

綜上所述，右歸飲煎劑、黃芪煎劑和蓮花醇提液具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

[1] 王曉玲,汪濤,汪雅妮,等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清對骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2011,38(2):363-365.

[2] 古今.當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪對小鼠造血功能的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(3):215-217．

[3] 岑潔,王怡.溫補(bǔ)腎陽法治療慢性腎衰竭—肉桂、附子和仙靈脾的應(yīng)用比較[J].上海中醫(yī)藥雜志,2007(12):20-22.