周 寧，Philip F.Haines，段云友，王 滔

（1南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院超聲科，廣東深圳518100；2美國布朗大學，美國羅德島州02912；3空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院超聲科，陜西西安710038；4美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院心血管研究所，美國賓夕法尼亞州19104）

0 引言

冠狀動脈造影（coronary angiography，CAG）可以直接評估冠狀動脈病變、狹窄程度，并且同時完成介入治療。雖然作為冠狀動脈狹窄診斷的“金標準”，但它只能得到冠狀動脈的解剖學評價，不能評價血流動力學指標以及反映冠狀動脈功能，并且是有創(chuàng)性檢查，因此其應用受到限制。冠狀動脈血流儲備（coro?nary flow reserve，CFR）是根據(jù)血流量增加的需求增加冠狀動脈血流量的能力，它是最大充血血流量（H）與冠狀動脈靜息（B）血流量的比值。CFR的測定可以評估冠狀動脈狹窄程度，并可評估冠狀動脈微循環(huán)的完整性和生理功能［1］。因此臨床醫(yī)生可以對整體疾病進行更合理的診斷和治療，而不僅僅是判斷冠狀動脈解剖學狹窄的程度。

高血壓心臟纖維化患者的心臟功能與CFR下降有關［2］。關于冠狀動脈血流量和CFR的研究已經(jīng)在臨床開發(fā)中，但由于技術原因，在動物模型中很少有研究報道。我們通過研究測量血管緊張素II（Ang II）和去氧腎上腺素（PE）誘導的心肌肥厚和纖維化小鼠的CFR，旨在獲得準確和可重復的小鼠冠狀動脈血流儲備的測量方法。我們希望通過本實驗為臨床相關的心臟疾病和藥物治療效果評估提供一種無創(chuàng)、可重復的動物模型和實驗方法。

1 材料和方法

1.1 動物 用 Ang II［0.432 mg／（kg·d）］和 PE［50 mg／（kg·d）］處理 C57BL／6J小鼠以誘導心臟肥大和纖維化2周作為實驗組。空白對照組不作處理。實驗組為10只Ang II＋PE處理的小鼠，對照組共8只，體質(zhì)量均為25～35 g。所有使用的方案均符合實驗動物管理評估和認證協(xié)會制定的指導方針，并獲得賓夕法尼亞大學動物護理和使用委員會的批準。

1.2 動物實驗方法 仰臥于加熱平臺上的小鼠用

1%～2.5%異氟醚氣體和氧氣的混合物吸入麻醉。使用直腸溫度探針監(jiān)測小鼠的體溫，并在整個過程中使用紅外加熱燈使其體溫保持在（37.0±0.5）℃。 通過加熱平臺上的電極墊監(jiān)測ECG信號，兩點心電圖連接到小鼠的右上和左下肢。心電信號可在超聲心動圖上實時顯示。ECG信號使得心臟收縮期和舒張期更容易被識別。使用化學脫毛劑（Nair）去除小鼠胸毛以減少超聲衰減。涂抹溫熱的超聲耦合劑的超聲波探頭（MS550D）置于小鼠胸部。

使用配備有MS550D換能器的高分辨率（40 MHz）Vevo 2100 成像系統(tǒng)（VisualSonics Inc.，Toronto，Canada）進行經(jīng)胸二維（2D）和彩色多普勒超聲心動圖研究。

1.3 經(jīng)胸超聲心動圖 從短軸切面和胸骨旁長軸切面獲得乳頭肌水平的二維圖像。然后使用超聲儀自帶圖像分析軟件（Vevo 2100，1.6，VisualSonic）下載和分析超聲圖像。測量至少三個心動周期，并對測量結(jié)果進行平均。基于2D的M?模式成像從胸骨旁左心室短軸切面測量左心室（LV）舒張末期（LVIDd）和收縮末期內(nèi)徑（LVID）以及射血分數(shù)（EF）和LV質(zhì)量。LV收縮功能通過LV EF和縮短率（FS，%）根據(jù)以下公式估算：FS（%）＝ ［（LVIDd－LVIDs）／LVIDd］×100%。

脈沖多普勒超聲心動圖在心尖四腔切面進行。將取樣容積放置在二尖瓣葉頂端的水平處，并且調(diào)整以測得二尖瓣多普勒流信號的最高舒張早期流速峰值。舒張早期峰值速度（E，A）及其比值（E／A）由二尖瓣多普勒波形得出。

1.4 冠狀動脈彩色多普勒超聲成像 除了用于評價心臟功能的超聲心動圖成像的標準切面外，我們采用了一系列改進并優(yōu)化的彩色多普勒成像技術顯示左冠狀動脈（left coronary artery，LCA）。通過優(yōu)化圖像，血流與超聲波束之間的角度保持在20°以下。使用脈沖多普勒測量冠狀動脈流速。測量的平均值是從三個連續(xù)的心動周期計算的。測量平均舒張流速、峰值舒張流速和速度時間積分（velocity?time integral，VTI）。

使用彩色多普勒成像，LCA的近端部分可在三種不同切面中顯示。它們是LV長軸切面、LV短軸切面和改良的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面是最好的（圖1）。因為它具有更高的可重復性，并且LCA的顯示率更高。在我們獲得了經(jīng)典的四腔心切面之后，只需將探頭稍向小鼠的頭部移動，在顯示肺動脈之前，就可以得到改良的五腔心切面，我們可以看到LCA的近端部分。只有在這種切面下，我們才可以獲得聲束與血流之間的角度小于20°的多普勒信號。而在LV短軸切面，我們通?？梢钥吹絃CA主干的二維結(jié)構(gòu)，但有時因為角度問題無法獲得其內(nèi)的血流信號。在LV長軸切面，由于角度問題（表1），LCA的VTI、峰值速度和平均速度的測量結(jié)果均低于我們從改良的五腔心切面獲得的結(jié)果。因此，我們選擇改良的五腔心切面作為LCA的最終測量切面。

圖1 左冠狀動脈三個檢查切面

表1 左室長軸切面及改良的五腔心切面下基礎狀態(tài)及充血狀態(tài)下左冠狀動脈測值

1.5 冠狀動脈CFR檢測 通過面罩吸入3%的異氟烷誘導麻醉小鼠，之后保持在2%的濃度。將異氟醚濃度降至1%，在3 min后穩(wěn)定時獲取多普勒信號并將其存儲在計算機中，將所測數(shù)據(jù)冠脈流量作為基線水平（B）。然后異氟醚水平增加到2.5%，以增加冠脈流量，3 min后多普勒波形穩(wěn)定，存儲多普勒頻譜，所測數(shù)據(jù)作為充血后水平（H）。按照前述方法分別獲得基線及充血狀態(tài)下LCA的多普勒頻譜。我們建議在整個過程中使用控制臺系統(tǒng)而不是用手來控制探頭。只有這樣，才能較一致且穩(wěn)定地獲得LCA的多普勒頻譜。如果在3 min內(nèi)用手握住探頭，則很難將探頭保持在同一點。值得注意的是，當將異氟醚減少至1%時，有時候小鼠會有清醒的趨勢，可能會有移動，這時需要調(diào)整探頭的位置以獲得LCA圖像。

1.6 統(tǒng)計分析 所有數(shù)值均以±s表示。使用t檢驗分析組間差異。對于所有分析（Prism 5，GraphPad?Inc，San Diego，CA），P＜0.05 時被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組小鼠心肌肥大及纖維化 Ang II＋PE處理的小鼠與對照組相比發(fā)生中度心肌肥厚，小鼠心肌重量增加，EF正常，舒張功能障礙表現(xiàn)為二尖瓣 E減低（P＜0.05，表2）。

表2 在未處理的空白對照組小鼠和Ang II＋PE處理的小鼠心臟相關測量值

2.2 小鼠左冠狀動脈CFR測量結(jié)果 左冠狀動脈近端血流在改良的五腔心切面可以較好地被測量（圖2）。Ang II＋PE處理的小鼠在充血狀態(tài)下舒張期峰值速度（PDV），平均速度和VTI降低。CFR（PDV，平均速度和VTI的H／B比）顯著降低（表3）。

圖2 左冠狀動脈血流頻譜

3 討論

由于冠狀動脈很小，位于胸腔深處并且由于它們附著于心外膜表面而處于恒定運動狀態(tài)，因此超聲波對于冠狀動脈血流的無創(chuàng)測量是困難的。本研究證明，無創(chuàng)左冠狀動脈血流和CFR評估在不使用藥物誘導冠脈血流儲備發(fā)生變化的小鼠中是可行的。使用高頻超聲心動圖技術可以較容易地測量小鼠LCA近端血流。

表3 在未處理的空白對照組小鼠和Ang II＋PE處理的小鼠中基礎狀態(tài)和充血狀態(tài)下的左冠狀動脈CFR

左主干冠狀動脈多普勒頻譜的典型表現(xiàn)是舒張期主導的血流頻譜。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)冠狀動脈血流頻譜可以在三種不同的切面中獲得，它們分別是左室長軸切面、短軸切面和改進的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面被認為是測量左主干冠狀動脈的最佳切面。在改良的五腔心切面觀察中獲得的冠狀動脈血流速度的測量結(jié)果高于其他兩個切面中的測量結(jié)果，并且顯示率也較高。在長軸和短軸切面中，聲束與血流之間的角度通常超過20°，導致血流速度測量誤差；特別是在短軸切面左冠狀動脈起始段大部分時間內(nèi)幾乎與聲束相互垂直時，只能觀察到二維的LCA結(jié)構(gòu)圖像，但無法獲得血流圖像；即使得到LCA的多普勒頻譜，但得到的LCA的速度和VTI要比它在改良的五腔心切面中得到的要低。在改良的五腔心切面，LCA血流與超聲波束之間的角度基本上可以小于20°，并且顯示率可以達到100%。

CFR是最大冠狀動脈充血流量與基線血流的比值，使用經(jīng)胸多普勒超聲心動圖（transthoracic doppler echocardiography，TTDE）評估，已用于臨床評估冠狀動脈狹窄嚴重程度［1］和檢測心肌微血管功能障礙［3］。臨床TTDE CFR方案也適用于小鼠實驗，以評估動脈粥樣硬化小鼠的左冠狀動脈最小管腔直徑［4］以及心肌炎模型中的微血管功能障礙［5］。Wikstr?m等［6］使用經(jīng)胸超聲心動圖評估腺苷誘導的小鼠冠狀動脈血流儲備。他們發(fā)現(xiàn)，CFR似乎是用于評估小鼠體內(nèi)冠狀動脈功能的更可靠的方法。在該項研究中，他們使用腺苷來獲得冠狀動脈血流的充血狀態(tài)。

給予特定的冠狀血管舒張劑如腺苷［7－8］是評估冠狀動脈血流儲備所必需的，已經(jīng)應用于臨床實驗中，但這在靜脈更難以插管并且耐受劑量和容量更小的小鼠中更成問題。有人偶然地發(fā)現(xiàn)，最廣泛使用的麻醉劑之一——異氟烷氣體在較高濃度下也是冠狀血管擴張劑［9］。使用吸入性冠狀血管舒張劑，如果有效并且耐受性良好，將大大簡化對小鼠冠狀動脈血流儲備的檢測，并使該方法真正無創(chuàng)。2010年，Hart?ley等［10］發(fā)現(xiàn)，通過將異氟醚氣體麻醉的濃度從1%改變?yōu)?.5%，冠狀動脈血流速度可以從基線（B）增加至充血（H）水平，并且H水平與腺苷誘導的相似或更高。他們在實驗中將探頭放置在小鼠左側(cè)胸部，并將取樣容積放置于深度2.5 mm處，朝向左主冠狀動脈的起點。冠狀動脈血流信號多普勒頻譜在顯示器上通過流向為朝向探頭的舒張早期峰值血流進行識別。在該研究中，他們通過移動探頭發(fā)現(xiàn)冠狀動脈血流波形譜時識別冠狀動脈，而不是直接觀察冠狀動脈血流，因此結(jié)果可能會出現(xiàn)偏差。在本研究中，我們吸取以往研究的優(yōu)點，使用不同的異氟醚濃度來獲得B和H水平，而不使用藥理學試劑；并通過比較，選擇了LCA測量的最佳切面，可以直接觀察到冠狀動脈，獲得較為準確的冠狀動脈血流參數(shù)。證實了通過經(jīng)胸超聲心動圖這種無創(chuàng)的檢查手段獲得LCA起始段的血流頻譜，且該方法的可行性和可重復性較好。

有研究［11］表明，臨床患者的冠狀動脈CFR顯示率高達95%～100%，具有良好的可行性和可重復性。在本研究中，冠狀動脈左支起始段CFR在改良的五腔心切面觀察中的檢測成功率在小鼠中也提高到了100%，并且與報道的一致。小鼠的靜脈難以插管并且耐受劑量和容量更小，因此，以往對于使用臨床使用腺苷之類藥物誘導檢測冠狀動脈在小鼠動物模型中較難實現(xiàn)。通過本實驗避免了靜脈使用腺苷等藥物誘導，且在實驗室大部分的小鼠模型的麻醉方法均為使用吸入用異氟醚麻醉，通過吸入面罩調(diào)節(jié)劑量在實驗中也十分方便。在本實驗中，我們成功檢測到，使用Ang II＋PE處理的心肌肥大及纖維化小鼠的左冠狀動脈CFR明顯減低。

4 結(jié)論

在不使用藥物的情況下，無創(chuàng)冠狀動脈血流儲備評估在小鼠實驗模型中是可行的。通過本實驗的驗證，可以建立臨床相關的心臟疾病小鼠動物模型，并通過經(jīng)胸彩色多普勒超聲對動物模型的冠狀動脈血流儲備進行監(jiān)測，為疾病的診斷、藥物或其他治療方法的效果評估提供一種無創(chuàng)、可重復的實驗方法。

［1］Hozumi T，Yoshida K，Ogata Y，et al.Noninvasive assessment of significant left anterior descending coronary artery stenosis by coronary flow velocity reserve with transthoracic color Doppler echocardiography［J］.Circulation，1998，97（16）：1557－1562.

［2］Youn HJ，Ihm SH，Lee JM，et al.Relation between flow reserve capacity ofpenetrating intramyocardialcoronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension：study using transthoracic Doppler echocardiography［J］.J Am Soc Echocardiogr，2006，19（4）：373－378.

［3］Bartel T，Yang Y，Müller S，et al.Noninvasive assessment of microvascular function in arterialhypertension bytransthoracic Dopplerharmonic echocardiography［J］.J Am Coll Cardiol，2002，39（12）：2012－2018.

［4］Wikstr?m J，Gr?nros J，Bergstr?m G，et al.Functional and morphologic imaging of coronary atherosclerosis in living mice using high?resolution colorDopplerechocardiography and ultrasound biomicroscopy［J］.J Am Coll Cardiol，2005，46（4）：720－727.

［5］Saraste A，Kyt? V，Saraste M，et al.Coronary flow reserve and heart failure in experimental coxsackievirus myocarditis.A transthoracic Doppler echocardiography study［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（2）：H871－H875.

［6］Wikstr?m J，Gr?nros J，Gan LM.Adenosine induces dilation of epicardial coronary arteries in mice：relationship between coronary flow velocity reserve and coronary flow reserve in vivo using transthoracic echocardiography［J］.Ultrasound Med Biol，2008，34（7）：1053－1062.

［7］Marcus ML.The coronary circulation in health and disease［M］.New York：McGraw?Hill，1983.

［9］Reiz S，B?lfors E，S?rensen MB，et al.Isoflurane??a powerful coronary vasodilator in patients with coronary artery disease［J］.Anesthesiology，1983，59（2）：91－97.

［10］Hartley CJ，Reddy AK，Michael LH，et al.Coronary flow reserve in mice：effects of age，coronary disease，and vascular loading［J］.Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc，2010，2010：3780－3783.

［11］Winter R.Feasibility of noninvasive transthoracic echocardiography／doppler measurement of coronary flow reserve in left anterior descending coronary artery in patients with acute coronary syndrome：a new technique testedin clinicalpractice［J］.JAm Soc Echocardiogr，2003，16（5）：464－468.