潘鵬亮，王國(guó)君，2，張方梅，劉紅敏，2，史洪中，2，尹　健

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院/豫南植物有害生物綠色防控院士工作站，河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)師范學(xué)院 大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽(yáng) 464000)

茶尺蠖(EctropisobliqueProu)是我國(guó)茶產(chǎn)區(qū)的重要害蟲(chóng)之一，以幼蟲(chóng)取食茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) Kuntze]葉片，不但會(huì)造成減產(chǎn)，還影響茶樹(shù)來(lái)年長(zhǎng)勢(shì)[1]。在制定此類(lèi)害蟲(chóng)的防治適期時(shí)，除了根據(jù)誘捕到的成蟲(chóng)數(shù)量，推測(cè)幼蟲(chóng)孵化高峰期以外[2]，還可以通過(guò)田間調(diào)查幼蟲(chóng)蟲(chóng)口數(shù)量或危害嚴(yán)重度來(lái)決定采取有效的防治方法。此外，蟲(chóng)口數(shù)量和危害嚴(yán)重度調(diào)查還用于驗(yàn)證防治效果。然而，由于茶尺蠖幼蟲(chóng)具有畏光性和保護(hù)色，受驚動(dòng)后吐絲逃跑等特點(diǎn)[3]，調(diào)查其蟲(chóng)口數(shù)量難度較大。被害葉率和被害葉嚴(yán)重度是評(píng)估植物病害發(fā)生程度的重要指標(biāo)，這些指標(biāo)同樣也可能被用于評(píng)估蟲(chóng)害嚴(yán)重度。據(jù)報(bào)道，茄二十八星瓢蟲(chóng)(HenosepilachnavigintioctopunctataFabricius)成蟲(chóng)取食茄子葉片的面積可以通過(guò)葉面儀測(cè)量方法獲得[4]。鐘取發(fā)等[5]提出一種基于葉片模板自動(dòng)匹配的葉片蟲(chóng)損面積測(cè)量方法，并對(duì)10類(lèi)不同葉片以及這些葉片的蟲(chóng)損面積進(jìn)行了測(cè)量評(píng)估，平均相對(duì)誤差為4.78%。這說(shuō)明，通過(guò)圖像處理技術(shù)有可能實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)危害葉片嚴(yán)重度的評(píng)估。目前，大多數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道均是對(duì)不同植物正常葉片面積進(jìn)行測(cè)量[6]，涉及到的植物范圍很廣，比如農(nóng)作物[7-8]、瓜果[9-10]、蔬菜[11]、雜草[12]、林木[13-14]、花卉[15]等。使用的測(cè)量技術(shù)包括圖像處理法[16-17]、方格法、鮮質(zhì)量法、紙質(zhì)量法、光電面積儀法、求積儀法、線性回歸估測(cè)法等[18]。然而，對(duì)茶樹(shù)葉片面積和害蟲(chóng)危害茶葉面積進(jìn)行測(cè)量和評(píng)估的報(bào)道還不多見(jiàn)。本研究擬利用圖像處理和幾何形態(tài)測(cè)量學(xué)方法，對(duì)茶樹(shù)不同葉位葉面積和葉片各幾何形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，對(duì)茶尺蠖危害茶樹(shù)葉片蟲(chóng)損葉面積進(jìn)行評(píng)估，驗(yàn)證此技術(shù)評(píng)估茶樹(shù)害蟲(chóng)危害茶樹(shù)葉片嚴(yán)重度的可行性。

1　材料和方法

1.1　植物種類(lèi)

茶樹(shù)葉片采自豫南植物有害生物綠色防控院士工作站試驗(yàn)基地8～10年生茶園，其位于河南省信陽(yáng)市浉河港鎮(zhèn)，茶樹(shù)品種為福云7號(hào)，是當(dāng)?shù)亟鼛啄晖茝V的主栽品種之一。對(duì)照植物垂絲海棠(MalushallianaKoehne.)和梔子花(Gardeniajasmindoesvar.grandifloraNakai.)葉片采自信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院校內(nèi)。

1.2　取樣和處理方法

茶樹(shù)枝條取2017年6月初修剪后生長(zhǎng)出的新生枝，每枝1芽5葉左右。分2組，一組為無(wú)明顯被取食的枝條(65枝，共342片葉)，一組是被茶尺蠖危害的枝條(65枝，共352片葉)。采集葉片時(shí)茶樹(shù)葉片被害率低，茶尺蠖呈點(diǎn)片發(fā)生。垂絲海棠9枝，梔子花9枝，均為當(dāng)年生枝條，每種植物取50片單葉作為測(cè)量對(duì)象。所有枝條被采集后48 h內(nèi)進(jìn)行葉片平展處理。

1.3　圖像獲取方法

參考劉時(shí)城等[12]處理植物葉片時(shí)采用的圖像掃描分辨率即300 dpi對(duì)所有植物葉片進(jìn)行圖像獲取。在獲取葉片圖像時(shí)，使用愛(ài)普生平板式掃描儀(Epson Perfection V370 Photo)進(jìn)行24位全彩掃描，并在掃描玻璃板上方增補(bǔ)冷陰極光源(LP-300，Universal electronics industries ltd.)，以消除反射掃描時(shí)的葉片陰影。掃描時(shí)根據(jù)不同植物葉片大小進(jìn)行數(shù)量不等的批量操作，以節(jié)省時(shí)間。同時(shí)，為了后續(xù)的研究，掃描時(shí)葉尖向上，葉柄向下放置。

1.4　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

選取茶樹(shù)第4位葉50片，與海棠和梔子花葉片各50片進(jìn)行幾何形態(tài)特征參數(shù)的獲取，所使用的軟件為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)IPMist實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的BugShape v1.0，并通過(guò)單因素方差分析比對(duì)不同植物葉片各參數(shù)間的差異。通過(guò)獲取葉面積(Area)、葉片圖像長(zhǎng)軸長(zhǎng)度(LAL: long axis length)和短軸長(zhǎng)度(SAL: short axis length)，對(duì)3類(lèi)茶樹(shù)葉片，即無(wú)茶尺蠖危害枝條上的葉片(正常葉片NL: normal leaf)、被茶尺蠖危害枝條上的正常葉片(被害枝無(wú)損葉UL: undamaged-leaf in damaged-branches)和被茶尺蠖危害枝條上的受損葉(蟲(chóng)損葉DL: damaged-leaf)，進(jìn)行參數(shù)間的相關(guān)(Pearson correlation)和線性回歸(Linear regression)分析，建立相應(yīng)的回歸方程。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samplesttest)，分析不同葉位被害枝無(wú)損葉和正常枝葉面積、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度的差異。

在對(duì)蟲(chóng)損葉面積損失評(píng)估時(shí)，把受損葉分為3類(lèi)，即葉長(zhǎng)完整型、葉寬完整型、長(zhǎng)寬均完整型，分別利用不同葉位上葉面積與長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、葉面積與短軸長(zhǎng)度、葉面積與長(zhǎng)寬乘積建立的回歸方程，對(duì)蟲(chóng)損葉完整葉面積進(jìn)行擬合。擬合結(jié)果與實(shí)測(cè)蟲(chóng)損葉剩余面積之差作為害蟲(chóng)取食損失的面積。本研究利用正常葉片和被害枝無(wú)損葉建立的面積回歸方程分別計(jì)算蟲(chóng)損面積，同時(shí)，通過(guò)3次人工目測(cè)估計(jì)蟲(chóng)損面積，并進(jìn)行評(píng)測(cè)效果比較。此外，對(duì)不同葉位被害率以及被害枝蟲(chóng)損葉比例分布進(jìn)行了初步分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　茶樹(shù)葉片與對(duì)照植物葉片的差異

單因素方差分析結(jié)果表明，茶樹(shù)葉片與海棠和梔子花葉片在所提取的形態(tài)學(xué)參數(shù)，如面積(F=90.563,df=2,147;P<0.001)、周長(zhǎng)(F=31.899,df=2,147;P<0.001)、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度(F=49.545,df=2,147;P<0.001)、短軸長(zhǎng)度(F=142.561,df=2,147;P<0.001)、等效圓半徑(F=118.803,df=2,147;P<0.001)、偏心率(F=34.631,df=2,147;P<0.001)、緊湊度(F=146.297,df=2,147;P<0.001)、球狀性(F=60.745,df=2,147;P<0.001)、葉狀性(F=5.585,df=2,147;P=0.005)和圓形度(F=145.524,df=2,147;P<0.001)，差異均達(dá)到極顯著水平。多重比較(LSD或Games-Howell)結(jié)果表明，茶樹(shù)葉片與海棠葉片在各參數(shù)間均存在極顯著差異，與梔子花葉片相比，兩者之間在周長(zhǎng)、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、偏心率、緊湊度、球狀性、葉狀性和圓形度方面存在極顯著差異，而其他參數(shù)間差異不顯著(圖1)。

同組內(nèi)不同字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

2.2　茶樹(shù)葉面積與長(zhǎng)寬參數(shù)間的回歸分析

相關(guān)分析結(jié)果表明，無(wú)論是正常葉片、被害枝無(wú)損葉，還是蟲(chóng)損葉，所測(cè)得的葉面積與其長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、短軸長(zhǎng)度，以及長(zhǎng)軸長(zhǎng)度與短軸長(zhǎng)度之積均有極顯著的正相關(guān)關(guān)系。每一葉位的葉片面積與各參數(shù)均建立了顯著正相關(guān)線性回歸方程，其中，正常葉片面積與長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度之積的回歸系數(shù)為0.613～0.700，被害枝無(wú)損葉與其的回歸系數(shù)為0.610～0.682，蟲(chóng)損葉與其的回歸系數(shù)為0.617～0.679(表1)。

2.3　茶樹(shù)被害枝無(wú)損葉與正常枝葉面積差異

通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，在第3葉位和第5葉位，正常枝與被害枝完整葉片的面積存在極顯著差異，且正常葉片的面積大于被害枝無(wú)損葉，而2類(lèi)葉在第4、1、2、6葉位的面積無(wú)顯著差異。通過(guò)對(duì)長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度的分析發(fā)現(xiàn)，在第3葉位和第5葉位，正常葉的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度均極顯著大于被害枝無(wú)損葉，而第4葉位只有短軸長(zhǎng)度有極顯著差異(圖2)。

2.4　茶樹(shù)葉面積損失評(píng)估比較

為了比較不同方法評(píng)估蟲(chóng)損葉面積損失情況的差異，對(duì)正常葉不同葉位得到的回歸方程、無(wú)損葉回歸方程和人工目測(cè)估計(jì)結(jié)果進(jìn)行比較。單因素方差分析結(jié)果表明，通過(guò)正常葉和被害枝無(wú)損葉相關(guān)葉位的回歸方程得到的蟲(chóng)損葉面積，與人工評(píng)估方法得到的蟲(chóng)損葉面積之間無(wú)顯著差異(F=1.136，df=2,195;P=0.323)(圖3)。

表1　茶樹(shù)不同葉位葉面積與各參數(shù)的相關(guān)系數(shù)和回歸方程

**表示差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)

相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.5　茶樹(shù)被害枝不同葉位被害情況

通過(guò)對(duì)蟲(chóng)損葉被害情況的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)茶尺蠖種群密度不大的情況下，其取食茶樹(shù)葉片時(shí)，對(duì)不同葉位的葉片取食概率有明顯的差異，偏好性從強(qiáng)到弱的葉位順序?yàn)?、4、2、5、1、6，即在1年生6葉枝條上，最偏好取食第3葉位的成年葉片，而最不喜歡取食最下部的老葉(圖4)。

圖4　茶樹(shù)不同葉位蟲(chóng)損葉率分布

在所調(diào)查的被害枝條中，不同取食面積的蟲(chóng)損葉占1年生枝條葉片數(shù)的比例也有明顯的分布規(guī)律。即被害枝蟲(chóng)損葉面積在20%及以下的占總?cè)~片數(shù)的36.48%，在40%及以下的累積占67.30%，而被害枝蟲(chóng)損面積超過(guò)80%的葉片數(shù)量只占3.14%(圖5)。這說(shuō)明，當(dāng)蟲(chóng)口密度不大時(shí)，此類(lèi)害蟲(chóng)在田間的取食具有間斷性和枝條選擇的隨機(jī)性。

圖5　茶樹(shù)被取食葉面積大小在1年生枝條葉片中的頻率分布

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)證明，通過(guò)某些幾何形態(tài)特征提取軟件，可以自動(dòng)獲取到植物葉片的面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度，以及等效圓半徑等參數(shù)。這些參數(shù)可以用于對(duì)茶樹(shù)葉片、海棠葉片和梔子花葉片的區(qū)分。不同類(lèi)型的茶樹(shù)葉片(正常葉片、被害枝無(wú)損葉和蟲(chóng)損葉)面積與軟件提取到的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、短軸長(zhǎng)度以及兩者的乘積均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，每一葉位均可建立相應(yīng)的回歸方程。利用這些回歸方程對(duì)蟲(chóng)損葉被取食面積進(jìn)行評(píng)估，與人工實(shí)際評(píng)測(cè)的結(jié)果無(wú)顯著差異。正常葉與被害枝無(wú)損葉在第3、5葉位上，其面積存在顯著差異，即正常葉片面積大于被害枝無(wú)損葉。被害枝不同葉位被害情況分析表明，在茶尺蠖種群密度低時(shí)，其取食茶樹(shù)葉片具有明顯的葉位選擇偏好性，即在1年生6葉枝條上，偏好性從強(qiáng)到弱的葉位順序?yàn)?、4、2、5、1、6。在同一枝條上，蟲(chóng)損葉的比例分布也具有明顯的規(guī)律，即被害枝蟲(chóng)損葉率20%及以下的占36.48%，40%及以下的累積占67.30%，被害枝蟲(chóng)損率超過(guò)80%的只占3.14%。

本研究利用圖像處理與分析技術(shù)，對(duì)茶樹(shù)1年生枝條不同葉位葉片面積等參數(shù)進(jìn)行了軟件自動(dòng)獲取，避免了人工目測(cè)評(píng)估蟲(chóng)損葉面積受人為因素影響的不足，為茶尺蠖類(lèi)害蟲(chóng)危害茶樹(shù)嚴(yán)重度提供了科學(xué)的評(píng)估方法。研究中用到的幾何形態(tài)特征提取軟件BugShape v1.0較多地被應(yīng)用于各類(lèi)昆蟲(chóng)外部形態(tài)特征的提取[19-22]，穩(wěn)定性強(qiáng)，其最初版也被應(yīng)用于菟絲子種子的區(qū)分[23]，改良版用于鱗翅目昆蟲(chóng)[24]和鼠類(lèi)頭骨[25]形態(tài)特征的提取。本研究在一定程度上拓展了此類(lèi)軟件的應(yīng)用范圍。

在同類(lèi)研究中，袁哲明等[26]在測(cè)量十字花科蔬菜食葉害蟲(chóng)的食葉量時(shí)，利用計(jì)算機(jī)+手持式掃描儀+葉片復(fù)印紙的方法，獲取到目標(biāo)葉片面積。但該方法只適合于室內(nèi)用葉碟法測(cè)定食葉量，對(duì)害蟲(chóng)取食前葉片面積不固定或田間實(shí)際測(cè)量取食葉面積時(shí)，無(wú)法完成取樣測(cè)量。鐘取發(fā)等[5]提供的典型葉片模板自動(dòng)匹配法測(cè)量蟲(chóng)損葉面積最大相對(duì)誤差為8.22%，對(duì)于形狀復(fù)雜度低的葉片誤差較小，方法可行。但對(duì)生長(zhǎng)點(diǎn)無(wú)限生長(zhǎng)型植物如茶樹(shù)的葉片，需要建立不同成熟度的模板才能滿(mǎn)足實(shí)際需求，技術(shù)繁瑣，且沒(méi)有形成成熟的軟件產(chǎn)品，無(wú)法推廣應(yīng)用。本研究利用不同葉位長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、短軸長(zhǎng)度和長(zhǎng)軸與短軸長(zhǎng)度之積分別與面積建立回歸方程，可以分別模擬害蟲(chóng)取食后3種類(lèi)型(長(zhǎng)軸長(zhǎng)度完整、短軸長(zhǎng)度完整、長(zhǎng)軸和短軸均完整)葉片的原始葉片面積，進(jìn)而可對(duì)取食葉面積分別進(jìn)行評(píng)估，可操作性強(qiáng)。通過(guò)對(duì)比正常葉、受害枝無(wú)損葉回歸方程的計(jì)算結(jié)果和人工目測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方法在評(píng)測(cè)茶樹(shù)葉片被取食面積時(shí)無(wú)顯著差異。通過(guò)獲取不同植物葉片形態(tài)學(xué)參數(shù)，不但能夠區(qū)分植物葉片的種類(lèi)，在植物種類(lèi)鑒定中具有應(yīng)用價(jià)值，還能夠精確計(jì)算不同葉位面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、短軸長(zhǎng)度等，為建立植物生長(zhǎng)模型，以及評(píng)估害蟲(chóng)危害嚴(yán)重度[27]等提供可靠數(shù)據(jù)。

通過(guò)前期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，茶尺蠖幼蟲(chóng)密度在中等水平以下時(shí)，茶樹(shù)葉片被取食后絕大多數(shù)能夠保留葉長(zhǎng)或/和葉寬(占91.38%)，因此本研究未對(duì)葉長(zhǎng)和葉寬均被取食的類(lèi)型進(jìn)行評(píng)估。另外，通過(guò)研究葉片長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和短軸長(zhǎng)度建立的面積回歸方程，對(duì)該茶樹(shù)品種不同葉位的長(zhǎng)寬系數(shù)進(jìn)行了估計(jì)，即在無(wú)茶尺蠖危害的枝條上，系數(shù)范圍為0.613～0.700，被害枝條無(wú)損葉系數(shù)范圍為0.610～0.682。而在《農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程—茶樹(shù)》中，茶樹(shù)葉片大小的確定以葉長(zhǎng)、葉寬和系數(shù)0.7的乘積作為葉面積，忽略了不同品種、不同葉位長(zhǎng)寬系數(shù)的變化。

據(jù)報(bào)道，茶樹(shù)不同成熟度的葉片對(duì)茶尺蠖生長(zhǎng)發(fā)育有影響，成葉有利于其幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，老葉不利于取食[28]。這與本研究結(jié)果一致，即茶尺蠖偏好取食的葉位順序?yàn)榈?、4、2、5、1、6位葉。此外，本研究還在一定程度上證明了茶尺蠖危害茶樹(shù)葉片后引起其防御反應(yīng)[29]，如在被害枝上，無(wú)損葉片的葉面積小于正常未受害枝條葉面積，推測(cè)無(wú)損葉為防御茶尺蠖的危害在合成防御物質(zhì)時(shí)消耗了能量。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈佐銳教授和高靈旺副教授在軟件應(yīng)用方面提供了幫助與支持，信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院2013級(jí)植物保護(hù)專(zhuān)業(yè)學(xué)生常世江、李建豪等同學(xué)參與了前期的研究工作，在此一并致謝！