韓志慧，邢培翔，刁紅亮，胡軍，田晶，馬瑞燕*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 離石 033000)

梨小食心蟲(chóng)Grapholithamolesta(Busck)，簡(jiǎn)稱“梨小”，屬鱗翅目(Lepidoptera)，卷蛾科(Tortricidae)，是世界性的主要蛀果類害蟲(chóng)之一[1]。梨小食心蟲(chóng)寄主植物包括薔薇科的多種果樹(shù)[2,3]，如桃、梨、蘋(píng)果、李、杏、海棠、楊梅、山楂、枇杷等。該蟲(chóng)具有個(gè)體小、危害隱蔽、棲境多樣、世代重疊、轉(zhuǎn)寄主危害等特點(diǎn)，因此其預(yù)測(cè)、預(yù)報(bào)和防治較為困難[4,5]。

果園防治梨小食心蟲(chóng)的主要措施是噴灑化學(xué)殺蟲(chóng)劑和果實(shí)套袋[6]。過(guò)量施用化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境，極易產(chǎn)生抗藥性,危及食品安全，而果樹(shù)套袋人工成本巨大，影響果業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。隨著人們環(huán)保和食品安全意識(shí)的提高，生物防治逐漸引起人們的關(guān)注，如天敵防治[7]、性信息素防治[8]、病原微生物防治等，其中病原微生物防治害蟲(chóng)具有持效期長(zhǎng)、安全高效、不傷害天敵、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，可以有效地克服化學(xué)農(nóng)藥防治帶來(lái)的不良后果[9]。目前，應(yīng)用病原微生物對(duì)梨小食心蟲(chóng)進(jìn)行防治的報(bào)道不多，能見(jiàn)到的主要是蘇云金桿菌(Bt)和白僵菌[10]。

玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)，屬于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotian)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)棒束孢屬(Isaria)，是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌。玫煙色棒束孢寄主范圍廣，包括同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等8目[11]，能侵染煙粉虱[12]、桃蚜[13]、小菜蛾[14]、菜青蟲(chóng)[15]、柑橘木虱[16]等40多種昆蟲(chóng)，是生物防治重要的殺蟲(chóng)真菌之一。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物安全與生物防治研究組篩選出1株潛力生防菌株，保藏登記名稱為玫煙色棒束孢IF-1106。前期研究表明，該菌株對(duì)煙粉虱和桃蚜具有較高致病力。經(jīng)孢子懸浮液(1×107孢子·mL-1)處理的煙粉虱2齡若蟲(chóng)7 d后累計(jì)校正死亡率達(dá)83.05%[12]；經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理桃蚜后累計(jì)死亡率達(dá)91.7%[13]。

本研究在室內(nèi)條件下測(cè)定了玫煙色棒束孢IF-1106菌株對(duì)梨小食心蟲(chóng)的毒力，目的在于考察該菌株作為梨小食心蟲(chóng)生防活性物的潛力，為其防治梨小食心蟲(chóng)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲(chóng)源

梨小食心蟲(chóng)來(lái)自于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物安全與生物防治研究組繼代培養(yǎng)的梨小食心蟲(chóng)種群[17]。

1.1.2供試菌株

玫煙色棒束孢IsariafumosoroseaIF-1106菌株，保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3供試菌株孢子懸浮液的制備

玫煙色棒束孢IF-1106菌株試管斜面保存于4 ℃冰箱中。將玫煙色棒束孢轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，在(25±0.5)℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d。在無(wú)菌條件下，用0.1%吐溫-80溶液洗脫孢子，將懸浮液在磁懸浮攪拌器上搖動(dòng)30 min將成鏈的孢子打散，用4層醫(yī)用紗布過(guò)濾除去菌絲，血球計(jì)數(shù)板估計(jì)分生孢子濃度并稀釋至所需倍數(shù)。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)梨小卵的殺卵活性測(cè)試

試驗(yàn)方法以劉麗娟研究白僵菌對(duì)淡色庫(kù)蚊卵的致病力測(cè)定[18]的方法為基礎(chǔ)，參考《農(nóng)藥生物活性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范——SOP-SC-2063鱗翅目殺卵測(cè)定》并作適當(dāng)修改，具體方法為：取剛孵化(放置在(26±0.8)℃、相對(duì)濕度為70%～80%、光周期為L(zhǎng)∶D=15∶9 的培養(yǎng)箱中)24 h后的卵，將卵浸漬于孢子懸浮液中，1 s后取出保濕培養(yǎng)。每次處理20粒卵，6次重復(fù)，以0.1%吐溫-80水溶液進(jìn)行空白對(duì)照處理。

1.2.2對(duì)梨小幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性測(cè)試

試驗(yàn)方法以雷研園研究白僵菌對(duì)小菜蛾的致病力測(cè)定[19]的方法為基礎(chǔ)，參考《農(nóng)藥生物活性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范——SOP-SC-2049鱗翅目幼蟲(chóng)噴霧法》，并作適當(dāng)修改。具體方法為：在培養(yǎng)皿底部鋪一張濾紙，取大小基本相同健康的梨小食心蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)，將幼蟲(chóng)放在濾紙上，取2 mL孢子懸浮液用喉頭噴霧器噴霧，加入人工飼料，保濕飼養(yǎng)。每次處理15頭幼蟲(chóng)，6次重復(fù)，并以0.1%吐溫-80水溶液進(jìn)行空白對(duì)照處理。

1.2.3對(duì)梨小蛹的殺蛹活性測(cè)試

試驗(yàn)方法參考徐玲研究蟲(chóng)生真菌對(duì)黃粉蛹的毒力測(cè)定[20]，并作適當(dāng)修改。具體方法為：取剛化蛹(放置在(26±0.8)℃、相對(duì)濕度為70%～80%、光周期為L(zhǎng)∶D=15∶9 的培養(yǎng)箱中)24 h后的蛹，將蛹浸漬于孢子懸浮液中，1 s后取出，在無(wú)菌濾紙片上吸干表面水分后放置在含無(wú)菌濾紙片的平皿內(nèi)，保濕培養(yǎng)。每次處理15粒蛹，6次重復(fù)，并以0.1%吐溫-80水溶液進(jìn)行空白對(duì)照處理。

1.2.4對(duì)梨小成蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性測(cè)試

試驗(yàn)方法以袁盛勇球孢白僵菌對(duì)南瓜實(shí)蠅致病力測(cè)定[21]，參考《農(nóng)藥生物活性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范——SOP-SC-2044玻璃容器藥膜法》方法，并作適當(dāng)修改，具體為：使用試管作為藥膜容器，在試管口均勻粘取藥液并旋轉(zhuǎn)形成均勻藥液膜，稍微干燥后用該試管轉(zhuǎn)移梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)(使其在試管口沾上藥液)至250 mL燒杯中(燒杯底部以潤(rùn)濕濾紙平鋪，以保持容器內(nèi)部濕度)，達(dá)到數(shù)量后以雙層紗布封口，置于培養(yǎng)箱中。每次處理15頭成蟲(chóng)，6次重復(fù)，并以0.1%吐溫-80水溶液進(jìn)行空白對(duì)照處理。

1.3　數(shù)據(jù)處理

根據(jù)生物測(cè)定數(shù)據(jù)，分別計(jì)算不同處理蟲(chóng)態(tài)的死亡(侵染)率，并以Abbott公式進(jìn)行校正，即：

死亡率/%=處理死亡幼蟲(chóng)數(shù)×100/處理總蟲(chóng)數(shù)

(1)

孵化抑制率/%=處理亂未孵化數(shù)×100/處理總卵數(shù)

(2)

校正死亡率/%=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)×100/(100-對(duì)照組死亡率)

(3)

校正孵化抑制率/%=(處理組孵化抑制率-對(duì)照組孵化抑制率)×100/(100-處理組孵化抑制率)

(4)

蛹校正羽化抑制率的計(jì)算公式與卵校正孵化抑制率相同。采用Origin軟件繪制不同蟲(chóng)態(tài)的累計(jì)校正死亡率曲線圖，并采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　玫煙色棒束孢對(duì)梨小食心蟲(chóng)卵的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對(duì)梨小食心蟲(chóng)卵的校正抑制孵化率見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明：玫煙色棒束孢IF1106孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)卵的孵化有一定的影響，其中高濃度的孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)卵孵化的抑制作用更強(qiáng)。隨著孢子懸浮液濃度的升高對(duì)梨小食心蟲(chóng)卵孵化的抑制作用也逐漸增強(qiáng)(卵從接種后第3天開(kāi)始孵化，故本試驗(yàn)記錄第3～7天的孵化數(shù)據(jù))。經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理后校正孵化抑制率為79.61%，表現(xiàn)出較高的致病作用(表1)。被侵染的梨小食心蟲(chóng)卵先逐漸長(zhǎng)出白色菌絲，后逐漸被玫煙色狀菌絲完全覆蓋(圖2)，不再孵化。

2.2　玫煙色棒束孢對(duì)梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)的致病力

圖1　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲(chóng)卵的校正孵化抑制率Fig.1　The corrected hatching inhibition rate of G. molesta of the egg treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對(duì)梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)的校正死亡率見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)具有一定的致病力。隨著孢子懸浮液濃度的升高，幼蟲(chóng)死亡率由35.75%增加到58.89%。孢子懸浮液濃度為1×108孢子·mL-1時(shí)，致病作用最強(qiáng)，為58.89%。被侵染的幼蟲(chóng)長(zhǎng)出白色菌絲，蟲(chóng)體僵硬。

表1不同濃度孢子懸浮液對(duì)個(gè)梨小食心蟲(chóng)累計(jì)校正死亡(抑制)率對(duì)比/%

Table1Comparison of the cumulative corrected mortality (inhibition) rates of different concentrations of spore suspensions againstG.molesta

蟲(chóng)態(tài)Stage玫煙色棒束孢IF-106不同濃度孢子懸浮液/孢子·mL-1I. fumosorosea IF-1106 different concentrations of spore suspension1×1061×1071×108卵24.55C63.66B79.61A幼蟲(chóng)36.26C52.22B58.89A蛹8.05C70.12B100.00A成蟲(chóng)42.49A45.56A48.89A

注:同行不同大寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters within the same column are significantly different according to Tukey’s HSD(P<0.05).

圖2　玫煙色棒束孢IF-1106侵染卵的外部癥狀Fig.2　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected egg

圖3　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率Fig.3　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of larvae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

2.3　玫煙色棒束孢對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹的校正羽化抑制率見(jiàn)圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹具有一定的致病力，其中高濃度的孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹羽化的抑制作用更強(qiáng)。隨著孢子懸浮液濃度的升高對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹羽化的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。隨著孢子懸浮液濃度升高，對(duì)蛹羽化的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理后校正羽化抑制率為100%，表現(xiàn)出極高的致病作用。被感染的梨小食心蟲(chóng)蛹表面先長(zhǎng)出白色菌絲，后逐漸被玫煙色狀菌絲完全覆蓋(圖5)，不再羽化。

圖4　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲(chóng)蛹的校正羽化抑制率Fig.4　Corrected eclosion inhibition rate of G. molesta of pupae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

圖5　玫煙色棒束孢IF-1106侵染蛹的外部癥狀Fig.5　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected pupa

2.4　玫煙色棒束孢對(duì)梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對(duì)梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)的校正死亡率見(jiàn)圖6。試驗(yàn)結(jié)果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)具有一定的致病力。隨著孢子懸浮液濃度增加，梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率由42.49%增加到48.89%，致病作用逐漸增強(qiáng)。孢子懸浮液濃度為1×108孢子·mL-1時(shí)，對(duì)成蟲(chóng)致病作用最強(qiáng)，為48.89%。被侵染的成蟲(chóng)，蟲(chóng)體保濕培養(yǎng)后體表有玫煙色狀菌絲長(zhǎng)出。

玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對(duì)梨小食心蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)都具有一定的毒力，隨著孢子懸浮液濃度的升高毒力逐漸增強(qiáng)。梨小食心蟲(chóng)的卵和蛹對(duì)玫煙色棒束孢的敏感性較高，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，卵的孵化抑制率為79.61%，LC50值為6.10×106孢子·mL-1(表2)；蛹的羽化抑制率為100%，LC50值為1.15×107孢子·mL-1。梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)對(duì)玫煙色棒束孢的敏感性較低，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，幼蟲(chóng)的死亡率為58.89%，成蟲(chóng)的死亡率為48.89%。玫煙色棒束孢IF-1106對(duì)梨小食心蟲(chóng)的致病力表現(xiàn)為蛹>卵>幼蟲(chóng)>成蟲(chóng)，表明該菌株對(duì)梨小食心蟲(chóng)蛹和卵具有較高防效，而對(duì)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的防效較差。

圖6　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲(chóng)成蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率Fig.6　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of adult treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

表2對(duì)梨小食心蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)的毒力測(cè)定結(jié)果
Table2The results of the virulence test on different insect states ofG.molesta

蟲(chóng)態(tài)Stage毒力回歸方程Toxicity regression equationLC50/孢子·mL-1LC50LC50 95%置信限/孢子·mL-1LC50 (95% confidence limit)相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient卵y=0.144 9+0.758 2x6.10×1062.71×106～1.38×1070.978 0幼蟲(chóng)y=2.899 7+0.298 1x2.72×107—0.978 1蛹y=8.879 5+2.074 3x1.15×1071.81×106～9.03×1060.986 8成蟲(chóng)y=4.325 0+0.080 8x2.27×1081.96×108～2.64×1080.999 8

3　討論與結(jié)論

通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)玫煙色棒束孢的分生孢子在昆蟲(chóng)表皮附著，孢子出現(xiàn)突起，分生孢子萌發(fā)形成芽管和附著胞，并緊緊附著于寄主表皮生長(zhǎng)[22]。高濃度的孢子提高了單位昆蟲(chóng)體表玫煙色棒束孢的孢子數(shù)，增加了孢子侵染體表形成附著胞的幾率[23]，增強(qiáng)了玫煙色棒束孢的致病力。劉麗娟研究了球孢白僵菌對(duì)淡色庫(kù)蚊的致病力，結(jié)果表明隨孢子懸浮液濃度的增加菌株對(duì)淡色庫(kù)蚊卵的孵化抑制逐漸明顯[18]；袁盛勇研究球孢白僵菌對(duì)扶桑綿粉蚧成蟲(chóng)的致病力結(jié)果表明經(jīng)高濃度(2.0×108個(gè)·mL-1)孢子懸浮液處理后，成蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率最高[24]。這些研究與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致，即高濃度的生防菌孢子對(duì)于成功寄主至關(guān)重要。

不同蟲(chóng)態(tài)對(duì)生防菌的敏感度差異較大。高濃度的玫煙色棒束孢孢子對(duì)蛹的致病力為100%，這可能與蛹的表面物質(zhì)有關(guān)，這種物質(zhì)有利于真菌入侵，其侵染機(jī)制還有待研究。高濃度的玫煙色棒束孢孢子懸浮液對(duì)成蟲(chóng)的致病力為48.89%，防治效果較差，因?yàn)楦啐g的幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的表面有一層蠟質(zhì)，對(duì)分生孢子的侵入有一定的阻礙作用[25]。

利用昆蟲(chóng)病原真菌防治梨小食心蟲(chóng)不僅可以降低果實(shí)農(nóng)藥殘留量，而且更有利于維持生態(tài)平衡，保護(hù)天敵[26]。曹仲采用白僵菌(1.75 kg·hm-2)和對(duì)硫磺做膠露劑(0.2 kg·hm-2)混合液，防治枇杷園梨小食心蟲(chóng)取得了較好的效果[27]。梨小食心蟲(chóng)越冬幼蟲(chóng)多在樹(shù)基翹皮內(nèi)越冬，經(jīng)過(guò)白僵菌懸液對(duì)樹(shù)基的處理，結(jié)果表明用白僵菌防治梨小食心蟲(chóng)越冬幼蟲(chóng)有一定效果[28]。陳斌等人的研究結(jié)果表明球孢白僵菌菌株在室內(nèi)25 ℃條件下對(duì)西花薊馬成蟲(chóng)具有較高的毒力，但在自然條件下，感染球孢白僵菌的西花薊馬罹病蟲(chóng)體很少[29]。因此，使用玫煙色棒束孢防治梨小食心蟲(chóng)時(shí)，應(yīng)注意玫煙色棒束孢與殺蟲(chóng)劑、殺菌劑的混配使用，使“以菌治蟲(chóng)”的生物防治技術(shù)與其他害蟲(chóng)防治方法協(xié)調(diào)使用；若在其越冬代羽化期間，使用玫煙色棒束孢防治梨小食心蟲(chóng)，可以起到降低越冬蟲(chóng)源的作用。此外，蟲(chóng)生真菌在果園自然流行，可以對(duì)果園整個(gè)季節(jié)起到生態(tài)調(diào)控作用，在測(cè)報(bào)蛹期高峰期助增精準(zhǔn)釋放，效果更加。本試驗(yàn)是在室內(nèi)條件下進(jìn)行的，分生孢子與蟲(chóng)體充分接觸，而田間實(shí)際的溫、濕度均在變化，所以玫煙色棒束孢對(duì)梨小食心蟲(chóng)防治效果如何，需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

梨小食心蟲(chóng)的卵和蛹對(duì)玫煙色棒束孢的敏感性較高，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，卵的孵化抑制率為79.61%，LC50值為6.10×106孢子·mL-1；蛹的羽化抑制率為100%，LC50值為1.15×107孢子·mL-1。梨小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)對(duì)玫煙色棒束孢的敏感性較低，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，幼蟲(chóng)的死亡率為58.89%，成蟲(chóng)的死亡率為48.89%。本試驗(yàn)表明，玫煙色棒束孢IF-1106菌株可作為防治梨小食心蟲(chóng)的潛力菌株。