吳利敏，袁淑儀，趙晨華，潘啟根，樊素晗，田雪，王磊，李學(xué)軍

(河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

淇河鯽(Carassiusauratus)，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鯽屬(Carassius)，是鯽魚在漫長的進(jìn)化過程中形成的變異地方性種群之一，可以通過雌核發(fā)育這種單性生殖方式繁殖后代，在河南北部廣泛養(yǎng)殖，也是河南省特有的名貴魚類[1～4]。盡管淇河鯽具有很多優(yōu)良的性狀，但由于各種原因，淇河鯽的基礎(chǔ)研究和養(yǎng)殖開發(fā)都發(fā)展緩慢，導(dǎo)致其養(yǎng)殖規(guī)模和推廣地域都遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于彭澤鯽、異育銀鯽和工程鯽等鯽魚。自從淇河鯽被引種成為人工養(yǎng)殖對(duì)象，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，對(duì)淇河鯽苗種的需求量也增大，因此圍繞淇河鯽胚胎發(fā)育特性及其影響因素展開研究就顯得尤為必要。

探究淇河鯽胚胎發(fā)育特性，首先要對(duì)魚類早期發(fā)育的總體研究現(xiàn)狀有所了解。魚類胚胎發(fā)育是一個(gè)涉及了多種因素參與的復(fù)雜而連續(xù)的生長過程，涵蓋了外部形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化和胚胎組織間相互影響等階段，雖然起決定作用的是細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)等遺傳因素，但是正常的胚胎發(fā)育過程還常常要受到溫度、溶氧、pH值、鹽度、光照強(qiáng)度等多種生態(tài)因子的制約[5，6]。其中，溫度對(duì)魚類的生長發(fā)育繁殖及新陳代謝等各種生理機(jī)能都有巨大的影響，其產(chǎn)卵、胚胎發(fā)育、仔魚生長所需要的適宜溫度也不盡相同，而在這些生理過程中，胚胎發(fā)育對(duì)適宜的溫度最為依賴[6]。

多種研究表明不同的孵化溫度不僅會(huì)影響胚胎的孵化歷時(shí)，也會(huì)影響胚胎內(nèi)部的形態(tài)、胚胎孵化率與受精率，更甚者會(huì)影響仔魚的體長、卵黃囊大小及肌節(jié)的分化[7～10]。多數(shù)鯉科魚類孵化歷時(shí)3～4天不等，而影響其孵化歷時(shí)的最重要因素就是溫度；在非鯉科魚類中，溫度對(duì)胚胎及幼魚發(fā)育影響的研究更是數(shù)不勝數(shù)，并且這些研究結(jié)果均表明，在一定限度內(nèi)，隨著溫度的升高，胚胎發(fā)育進(jìn)程加快，且溫度對(duì)胚胎的孵化率與受精率均存在顯著影響，但溫度過高會(huì)影響胚胎成活率甚至?xí)绊懗醴踝恤~的生長及發(fā)育[11～21]。

根據(jù)郭永燦[8]的研究，鰱、草魚胚胎只有在16～33 ℃才能成活，對(duì)溫度較為敏感的發(fā)育階段有原腸期、囊胚期和出膜期，而原腸期是鰱、草魚胚胎對(duì)溫度最敏感的階段。觀察不同溫度下胡子鯰受精卵的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)低溫(20±1.5 ℃)條件中，在胚孔封閉前胚胎尚能保持正常發(fā)育，一旦到達(dá)器官分化時(shí)期則會(huì)出現(xiàn)尾芽無法伸長或背部隆起等畸形情況，并且在胚胎孵化前死亡[22]。陳昆慈等[23]認(rèn)為，寶石鱸胚胎正常發(fā)育溫度范圍是21～31 ℃，最適溫度在24～27 ℃，胚胎發(fā)育歷時(shí)與溫度成反比例關(guān)系。隨著對(duì)魚類胚胎溫度敏感性研究的深入，南海水產(chǎn)研究所李加兒等[24]發(fā)現(xiàn)，溫差對(duì)胚胎發(fā)育早期的影響較小，但是一旦進(jìn)入原腸期，不同溫度下的胚胎發(fā)育特性即呈現(xiàn)出明顯差異。

在自然條件或人工飼養(yǎng)條件下，常常會(huì)發(fā)生溫排水、天氣變幻、活魚運(yùn)輸以及生產(chǎn)養(yǎng)殖等引起的溫度驟變，所以探究溫度對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育影響具有很高的生產(chǎn)實(shí)際價(jià)值。異育銀鯽胚胎正常發(fā)育溫度范圍是13～25 ℃，孵化歷時(shí)隨溫度上升而縮短，最適溫度范圍內(nèi)孵化率最高[18]。溫度驟變對(duì)稀有鮈鯽胚胎不同發(fā)育階段的影響不同，胚孔封閉期是熱敏感期，眼基期耐受溫度驟變的能力大于肌肉效應(yīng)期[11]。

盡管生物機(jī)體對(duì)溫度的變化具有一定的適應(yīng)調(diào)控能力，但是這種調(diào)控能力有限，如果超出了適應(yīng)能力范圍，就會(huì)引起機(jī)體正常生命活動(dòng)受到干擾，極端情況下甚至可能造成死亡。確定胚胎發(fā)育的合適溫度是人工繁育所必須掌握的基礎(chǔ)生物學(xué)指標(biāo)。關(guān)于不同溫度對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育的影響的研究目前鮮有報(bào)道，因此，本研究初步展開溫度對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育影響的研究，也為探索雌核發(fā)育過程與普通兩性結(jié)合有性生殖的區(qū)別提供了一定的參考，更為生產(chǎn)上淇河鯽苗種繁育以及資源增殖提供參考資料。

1　材料和方法

1.1　親魚來源

淇河鯽取自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，在淇河鯽繁育季節(jié)挑取體質(zhì)健壯、性腺發(fā)育良好、個(gè)體大小均一的親魚(約500 g左右)。

1.2　人工催產(chǎn)及胚胎孵化

2017年4月20日將雌雄親魚按8∶1的比例放入親魚池，人工注射催產(chǎn)素，隨后放入養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行流水刺激，效應(yīng)時(shí)間結(jié)束后采用干法受精獲得受精卵，將受精卵均勻撒在15個(gè)直徑40 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，受精卵會(huì)黏在培養(yǎng)皿底部，每個(gè)培養(yǎng)皿中胚胎數(shù)量相仿，控制在100粒左右。然后將培養(yǎng)皿分為5組，每組3個(gè)平行，各組水溫分別控制在24，27，30，33 ℃；剩下一組作為對(duì)照保持在室溫(21 ℃左右)孵化。每隔10 min調(diào)整一次加熱棒，每次上調(diào)3 ℃，直到溫度穩(wěn)定在各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置的溫度。每天為各個(gè)溫度條件下胚胎換水一次，每次換水前將水溫調(diào)至實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度再換水，確保不影響胚胎發(fā)育。

1.3　胚胎觀察

參考馬海艷等關(guān)于銀鯽胚胎發(fā)育觀察結(jié)果[18]，定期觀察淇河鯽胚胎發(fā)育狀況，發(fā)育時(shí)序以50%的胚胎發(fā)育至某個(gè)時(shí)期的時(shí)間計(jì)算，用Zeiss顯微鏡觀察各時(shí)期胚胎特征并拍照，并統(tǒng)計(jì)胚胎從受精卵發(fā)育至卵裂期、囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚、尾芽、心跳、出膜等時(shí)期所用的時(shí)間。

1.4　溫度對(duì)淇河鯽胚胎受精率、孵化率以及發(fā)育速度的影響

孵化過程中定期選擇不同溫度一定數(shù)目的胚胎在顯微鏡下觀察其發(fā)育情況，并統(tǒng)計(jì)不同溫度下胚胎從一個(gè)時(shí)期發(fā)育到下一時(shí)期所用時(shí)間。在囊胚期統(tǒng)計(jì)不同溫度下胚胎的受精率，出膜期統(tǒng)計(jì)孵化率，為確保準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)胚胎受精率，本試驗(yàn)另外設(shè)置沒有受精的卵子作為對(duì)照。采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

受精率=受精卵數(shù)/卵子總數(shù)×100%

孵化率=孵出仔魚數(shù)/受精卵總數(shù)×100%

2　結(jié)果與分析

2.1　淇河鯽胚胎發(fā)育

淇河鯽胚胎發(fā)育特性與黃河鯉、異育銀鯽“中科3號(hào)”類似。在水溫(21±1)℃時(shí)，淇河鯽的胚胎發(fā)育經(jīng)歷約(71.95±0.34) h。根據(jù)其外部形態(tài)特征分為7個(gè)階段：受精、卵裂期、囊胚、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成和孵化出膜。淇河鯽胚胎發(fā)育過程中各時(shí)期特點(diǎn)如下：

受精卵：淇河鯽與異育銀鯽同屬銀鯽，受精卵類似，都為黏性卵，卵質(zhì)分布均勻，極性不明顯(圖1-1)。

桑葚胚期：在受精后，細(xì)胞開始分裂，先是一分為二，隨著發(fā)育的進(jìn)行，大約25 min分裂一次，在受精后(2.75±0.11)h左右，細(xì)胞越來越多，看起來狀如桑葚，此時(shí)就進(jìn)入了桑椹胚期(圖1-2)。

囊胚期：桑椹胚期后大約0.6 h，胚胎會(huì)很快進(jìn)入囊胚初期，此時(shí)細(xì)胞仍在繼續(xù)分裂但此時(shí)分裂的細(xì)胞數(shù)目很難看清楚，細(xì)胞堆積在動(dòng)物極一側(cè)，占整個(gè)細(xì)胞體積的1/3左右；在桑葚胚后(4.19±0.16)h(受精后(7.01±0.05)h左右)，分裂球圍繞卵黃逐漸向兩側(cè)延伸，分裂球變矮，最后像一頂帽子扣在卵黃上，此時(shí)胚胎發(fā)育便進(jìn)入了囊胚晚期(圖1-3)。

原腸胚期：在囊胚期后(5.55±0.18)h(受精后(12.55±0.05)h左右)，扣在卵黃上的帽子繼續(xù)圍繞卵黃下包，下包面積擴(kuò)大至整個(gè)胚胎的1/2，至此胚盾和胚孔還未出現(xiàn)，此時(shí)便完成了原腸胚中期的分裂(圖1-4)，在下包至2/3時(shí)，便完成了整個(gè)原腸胚的分裂。

神經(jīng)胚：在原腸胚中期后(2.84±0.14)h(受精后(15.34±0.22)h左右)，胚胎經(jīng)原腸胚繼續(xù)發(fā)育至神經(jīng)胚，此時(shí)胚層下包至胚胎的4/5，胚孔仍未完全閉合，此階段為魚類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟階段(圖1-5)。

肌節(jié)出現(xiàn)：在神經(jīng)胚后大約1.98 h(受精后17.31 h左右)，隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育，在神經(jīng)胚后不久，可觀察到胚孔完全閉合，在胚胎軀干中段出現(xiàn)了兩對(duì)肌節(jié)，進(jìn)入肌節(jié)出現(xiàn)期(圖1-6)。

尾芽期：在肌節(jié)出現(xiàn)后神經(jīng)胚后(8.65±0.12)h(受精后(25.97±0.32)h左右)，胚胎軀干部位中段可以看到四對(duì)體節(jié)，胚體尾部可看到明顯的小尾巴，進(jìn)入尾芽期(圖1-7)。

心跳期：在尾芽期后(9.45±0.15)h(受精后(35.39±0.37)h)，在頭部后方可看到心臟跳動(dòng)，且隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，心跳速度越來越快，并可清晰看到血夜循環(huán)的過程，此時(shí)進(jìn)入心跳期(圖1-8)。

出膜前期：在心跳期后(33±0.15)h(受精后(68.95±0.37)h)左右，胚胎在膜內(nèi)不斷擺動(dòng)，卵膜變薄變軟，此時(shí)進(jìn)入出膜前期(圖1-9)

出膜：出膜前期(3.55±0.13)h(受精后(71.95±0.34)h)后在頭部及尾部擺動(dòng)和相關(guān)酶的作用下，胚胎完成了孵化過程(圖1-10)。

2.2　不同溫度對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育影響

溫度對(duì)動(dòng)物胚胎發(fā)育至關(guān)重要，適宜的溫度能夠提升胚胎的孵化率，縮短胚胎的出膜時(shí)間。本研究設(shè)置了5個(gè)溫度梯度(21、24、27、30、33 ℃)，記錄不同溫度條件下淇河鯽胚胎發(fā)育各階段歷時(shí)及發(fā)育完成總歷時(shí)，并統(tǒng)計(jì)受精率與孵化率。從表1可以看出，不同溫度條件對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育所經(jīng)歷的時(shí)間有顯著影響，基本呈現(xiàn)發(fā)育時(shí)間與溫度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。但是不同溫度對(duì)胚胎發(fā)育初期(受精卵到桑椹胚)的歷時(shí)影響較小，而對(duì)胚胎發(fā)育后期(桑椹胚之后)所需時(shí)間影響較大(P<0.05)。同時(shí)結(jié)果顯示，過高的溫度(33 ℃)對(duì)淇河鯽胚胎是致命的，胚胎在囊胚期全部死亡(成活個(gè)體<5%)，可能是胚胎孵化相關(guān)酶的失活引起的。

圖1　淇河鯽胚胎發(fā)育Fig.1　Embryonic development of Qihe crucian carp　　注：1.受精卵；2.桑椹胚期；3.囊胚期；4.原腸胚期；5.神經(jīng)胚期；6.肌節(jié)出現(xiàn)期；7.尾芽期；8.心跳期；9.出膜前期；10.出膜?！　ote：1. fertilized egg；2. morula stage；3. blastula stage；4. gastrula stag；5. neurula stage; 6. sarcomere stage；7. tail-bud stage; 8. heart-beating stage; 9.pre-hatching stage; 10. Hatching stage.

2.3　不同溫度下胚胎的受精率與孵化率

由圖2和圖3可見，在21～27 ℃，淇河鯽胚胎受精率與孵化率隨著溫度的升高而升高；在27～33 ℃，受精率與孵化率隨著溫度的升高而降低。其中，27 ℃時(shí)胚胎的孵化率顯著高于其他溫度(P<0.05)，而胚胎的受精率卻在24 ℃時(shí)最高，但與27、30 ℃時(shí)卻沒有顯著性差異(P>0.05)，這也說明了溫度對(duì)于胚胎的受精率影響較小，而對(duì)胚胎的孵化率影響較大。

2.4　幾種鯽魚在不同溫度下胚胎發(fā)育歷時(shí)比較

從表2中可以看出，不同鯽魚胚胎發(fā)育歷時(shí)差別較大，但在(20±1) ℃這一溫度條件下均需經(jīng)歷大概72 h才能完成胚胎發(fā)育、出膜，其中白鯽胚胎發(fā)育速度較快(20.5～24.5 ℃時(shí)為41.7 h)。溫度對(duì)鯽魚胚胎發(fā)育的影響是顯著的，總體表現(xiàn)為在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高胚胎發(fā)育的時(shí)間逐漸縮短，多倍體鯽魚對(duì)溫度更加敏感。普安銀鯽在18 ℃時(shí)胚胎從受精卵到出膜經(jīng)歷了98.7 h，而在26 ℃時(shí)只用了48.2 h。芙蓉鯽在17.5～20.5 ℃時(shí)所需時(shí)間為73.0 h，當(dāng)溫度升高到20.5～24.5 ℃時(shí)胚胎發(fā)育的時(shí)間縮短到44.75 h。異育銀鯽“中科3號(hào)”在18 ℃需要時(shí)間94.27 h，而其在32 ℃時(shí)經(jīng)歷了28.47 h，這都與本研究中的淇河鯽的研究結(jié)果一致，表明了溫度對(duì)胚胎發(fā)育的時(shí)間有著顯著影響。

表1　不同溫度下淇河鯽胚胎發(fā)育各階段歷時(shí)Table 1　The time of Qihe crucian carp embryonic development need to each stage at different temperatures

注：1. 受精卵-桑椹胚 2. 桑椹胚-囊胚晚期；3. 囊胚晚期-原腸胚中期；4. 原腸胚中期-神經(jīng)胚；5. 神經(jīng)胚-尾芽；6. 尾芽-心跳；7. 心跳-出膜。不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。

Note: 1. fertilized eggs-segmentation-sphere; 2. segmentation-sphere-late blastocyst stage; 3. blastula stage-medium of gastrula stage; 4. medium of gastrula stage-neurula stage; 5. neurula stage-tail-bud; 6. tail-bud-heart-beating; 7. heart-beating-hatching stage.Different letters represent significance at 0.05 level.

3　討論

隨著社會(huì)的發(fā)展和養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，有關(guān)魚類胚胎發(fā)育的研究越來越多，淇河鯽作為河南地區(qū)特有的魚類，其養(yǎng)殖規(guī)模仍然較小，且有關(guān)其胚胎發(fā)育的研究也相對(duì)滯后。眾所周知，魚類胚胎發(fā)育易受溫度、pH及鹽度等外界環(huán)境因素的影響。其中溫度是影響胚胎發(fā)育的重要因子，本研究中對(duì)不同溫度條件下淇河鯽胚胎發(fā)育進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，淇河鯽胚胎發(fā)育完成所需要的時(shí)間縮短，但是溫度過高也會(huì)影響受精率與孵化率。

圖2　溫度對(duì)淇河鯽胚胎受精率的影響Fig.2　Effect of temperature on embryofertilization rate of Qihe Carassius auratus注：不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)。Note：Different lowercase indicates significant difference (P<0.05).

圖3　溫度對(duì)淇河鯽胚胎孵化率的影響Fig.3　Effect of temperature on embryo hatchability rate of Qihe Carassius auratus注：不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)Note：Different lowercase indicates significant difference (P<0.05)

魚類的胚胎發(fā)育過程具有相似性，但相似性度與親緣關(guān)系有關(guān)，親緣關(guān)系越近，其相似性也越高。通過胚胎觀察發(fā)現(xiàn)淇河鯽胚胎發(fā)育特性與黃河鯉、異育銀鯽“中科3號(hào)”類似。根據(jù)其外部形態(tài)特征分為受精階段、卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚階段、器官形成階段和孵化出膜7個(gè)階段，在21 ℃左右，淇河鯽的胚胎發(fā)育經(jīng)歷約72 h?？傮w來看，在胚胎發(fā)育前期，淇河鯽與異育銀鯽、黃河鯉等魚類相似。但淇河鯽也有其獨(dú)特性，在神經(jīng)胚、尾芽、心跳等后期發(fā)育階段與黃河鯉、銀鯽中科III號(hào)差別較大，由于淇河鯽卵膜較厚，所以在心跳期并不能像黃河鯉那樣可以清楚可以看到全身血夜流動(dòng)，只能看到心臟周圍小部分的血液流動(dòng)；同時(shí)，在心跳期之后，可以看到胚體在卵黃中轉(zhuǎn)動(dòng)，但在黃河鯉中并未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[30]。這也暗示了胚胎發(fā)育后期的不同可能是造成不同魚類差異巨大的原因，但這一推測(cè)需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表2　幾種鯽魚不同溫度孵化時(shí)間的比較Table 2　Comparison of incubation temperature and incubation rime of several crucian carp

胚胎對(duì)外界溫度極為敏感，溫度過高或者過低，都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育出現(xiàn)停滯或者中斷。本研究通過觀察不同溫度下淇河鯽胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)淇河鯽胚胎在21～30 ℃都可以孵化成功，而且孵化完成所需時(shí)間隨著溫度的升高而縮短，這與同為三倍體的異育銀鯽相似性最高[29]，但與普通的二倍體鯽魚相差較大，推測(cè)可能四倍體彭澤鯽及經(jīng)雌核發(fā)育三倍體淇河鯽、異育銀鯽的胚胎對(duì)外界溫度的變化更為敏感，這可能是因?yàn)槁蚜殉跗谶z傳物質(zhì)復(fù)制或者染色體加倍周期延長，溫度條件的變化容易導(dǎo)致卵質(zhì)中的與胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)能力下調(diào)，信息傳遞途徑受阻的原因[28]。

生物體內(nèi)很多生化反應(yīng)都是由生物酶催化的，而酶只有在最適的溫度下才能發(fā)揮最強(qiáng)的催化作用。溫度提高可以加快反應(yīng)速度，但是溫度過高會(huì)使酶失去活性，使體內(nèi)許多生化反應(yīng)停止[31～33]。硬骨魚類中的研究發(fā)現(xiàn)，高溫或低溫對(duì)胚胎發(fā)育后期的器官分化及形成過程影響較大，因影響器官分化過程所需酶活性，導(dǎo)致器官分化進(jìn)程紊亂致畸或者滯育，極大的阻礙了胚胎的正常發(fā)育[34]。溫度對(duì)于淇河鯽胚胎的受精率與孵化率均存在明顯的影響，試驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)，沒有受精的卵子仍可以進(jìn)行正常分裂并發(fā)育至囊胚期，所以我們?cè)谀遗咂陂_始統(tǒng)計(jì)受精率，在囊胚之后不再分裂并且死亡的胚胎為沒有受精的胚胎。33 ℃時(shí)，胚胎在囊胚期全部死亡，推測(cè)可能是溫度過高影響了淇河鯽卵子受精率，但也不能排除溫度過高導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中所需的酶失活，進(jìn)而導(dǎo)致了胚胎的死亡這種可能性。其他溫度下，胚胎發(fā)育進(jìn)程均隨著溫度的升高而加快，但溫度過高會(huì)影響胚胎的孵化率與受精率，推測(cè)這是由于溫度過高導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中某些酶的異常工作造的。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)淇河鯽胚胎在27 ℃孵化率顯著高于其他溫度，而受精率卻在24 ℃最高，說明淇河鯽胚胎卵子最適受精溫度與胚胎最適孵化溫度不同。

總之，沒有適宜的溫度就沒有生命。確定胚胎發(fā)育的合適溫度對(duì)于解釋其地理分布具有一定的參考價(jià)值。淇河鯽是天然雌核發(fā)育三倍體，鑒于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，確立溫度對(duì)淇河鯽胚胎發(fā)育及受精率與孵化率的影響，可以為生產(chǎn)上淇河鯽苗種培育提供一定的理論指導(dǎo)，也可以為后續(xù)的生產(chǎn)提供參考。

4　結(jié)論

淇河鯽胚胎發(fā)育歷時(shí)與溫度有一定相關(guān)性，在21～30 ℃都可以孵化成功，而且孵化完成所需時(shí)間隨著溫度的升高而縮短；但是由于溫度升高對(duì)胚胎受精率和孵化率產(chǎn)生影響，所以生產(chǎn)上為了提高效益可以在早期采用24 ℃孵化，保證較高的受精率；隨后采用27 ℃孵化，提高孵化率。