郝慶玲，朱芷葳，許冬梅，李鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801)

CMKLR1(Chemokine-like receptor 1)為趨化因子樣受體1，在人類研究中也稱ChemR23，屬于分泌型蛋白[1]。CMKLR1在動物體內(nèi)廣泛表達，尤其在心肌細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、脂肪細胞中顯著高表達[2]。Arita等研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1在具有免疫及造血功能的組織中廣泛表達，如骨髓、脾臟、胎兒肝臟、淋巴結、胸腺和闌尾等[3]。1996年Owman等從人B淋巴母細胞cDNA文庫中鑒定出一段與G蛋白偶聯(lián)受體家族(G-protein coupled receptor, GPCRs)高度同源的cDNA序列，將其命名為CMKLR1，后來研究證實為Chemerin脂肪因子的天然受體[4]。

目前，對CMKLR1生物學功能的研究主要有以下幾方面：(1)參與免疫與炎性反應[5～7]。當動物機體出現(xiàn)炎性反應時，巨噬細胞和樹突狀細胞發(fā)揮其抗原遞呈作用，向炎性反應部位集合，通過CMKLR1與其配體Chemerin相互作用，誘導胞內(nèi)鈣離子釋放和磷酸化，同時胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 通過結合Gi-偶聯(lián)的異源三聚體來抑制cAMP的累積，從而完成對炎性部位的免疫反應。目前認為，肥胖屬于慢性低水平的炎性狀態(tài)，可引起脂肪組織炎性反應。Cash等通過研究小鼠脂肪細胞的抗炎特性發(fā)現(xiàn)，其抗炎機理可能是Chemerin通過募集表達有CMKLR1的巨噬細胞和漿細胞樣樹突狀細胞聚集，從而激活免疫細胞發(fā)揮抗炎特性[8]；(2)調(diào)節(jié)脂肪細胞分化[9]。Goralski等通過對沙鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在沙鼠脂肪細胞分化的早期階段和脂肪細胞成熟時，CMKLR1表達顯著增加；通過基因沉默技術進一步研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1在脂肪細胞分化早期(前3 d)具有重要作用，但在第4天將CMKLR1基因沉默，則對脂肪細胞分化和脂肪細胞表型無明顯影響；(3)參與胰島素抵抗[10]。Takahashi等通過培養(yǎng)小鼠3T3-L1細胞研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1與其配體Chemerin相互作用，可顯著增加胰島素刺激引起的葡萄糖攝入，并能提高ISR-1(胰島素受體底物-1)酪氨酸的磷酸化水平，增強胰島素刺激信號。

課題組前期對牛卵泡顆粒細胞(Granulosa cells, GCs)轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1 mRNA在從屬卵泡表達量極顯著高于優(yōu)勢卵泡，提示CMKLR1對牛卵泡發(fā)育具有重要調(diào)控作用[11]。因此，本研究選取牛卵泡作為研究對象，經(jīng)RT-PCR擴增并克隆牛CMKLR1全CDS區(qū)，對其編碼的蛋白序列進行結構和功能分析，為后期深入研究CMKLR1對牛卵泡發(fā)育的影響奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料

本試驗材料來源于山西省文水縣肉牛屠宰場，選擇海福特母牛，屠宰后采集雙側均正常發(fā)育卵巢，投入DPBS中帶回實驗室，修剪卵泡并分離GCs，-80 ℃保存。

試驗中用到的試劑主要包括：Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker 2000、Tap DNA 聚合酶、dNTP、瓊脂糖(均購自TAKARA)。

1.2　試驗方法

1.2.1顆粒細胞分離

選擇直徑>5 mm的卵泡，在盛有DPBS的平皿中從中線剪開，小心刮取卵泡內(nèi)細胞并丟棄卵泡膜性組織，將平皿內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃-Z1 400 r·min-1離心5 min，棄上清即為GCs。

1.2.2引物的設計與合成

參考GenBank提供的牛CMKLR1 mRNA(NM_001145235.1)核酸序列，Primer 5.0設計特異性引物，交由TAKARA公司合成，引物序列如下：

上游：5'-ATGGAGGCTGAGGATTACAACGCCTC-3'

下游：5'-TCAGAGCATGCCAGTCTCCCTC-TCGT-3'

1.2.3總RNA抽提與RT-PCR

Trizol法提取GCs總RNA，經(jīng)核酸測定儀檢測合格后，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系10 μL：5×Prime Script TM Buffer 2 μL，Prime Script TMRT Enzyme Mix1 0.5 μL，Oligo dT Primer 25 pmol，隨機引物50 pmol，Total RNA 1 μL，DEPC定容至10 μL，混勻后置于PCR儀，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.4全CDS區(qū)擴增

擴增體系為：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2 μL，上下游特異性PCR引物各0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μL，Taq聚合酶0.25 μL，ddH2O加至25 μL。擴增程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%凝膠電泳檢測后膠回收試盒回收純化PCR產(chǎn)物，送交TAKARA公司測序。

1.3　生物信息學分析

測序結果CDS區(qū)分析應用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；NCBI在線BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對24種動物CMKLR1氨基酸序列比對分析；在線軟件NetOGlyc4.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、NetNGlyc1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對CMKLR1一級結構O-糖基化、N-糖基化和磷酸化位點分別分析；3D結構和結構域用 Conserved Domain Search Services (CD Search) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析。

2　結果與分析

2.1　RT-PCR分析

總RNA提取后，經(jīng)核酸檢測儀檢測，RNA濃度和純度均符合后續(xù)實驗要求。PCR擴增結束后，凝膠電泳檢測可見條帶大小為1 100 bp左右，與預期結果相符(圖1)。

2.2　牛卵泡CMKLR1序列分析

測序結果顯示，牛卵泡CMKLR1基因CDS區(qū)全長1 089 bp，編碼362個氨基酸；HMMTOP v2.0分析表明，CMKLR1蛋白序列中存在7個跨膜區(qū)段(圖2中下劃線部分)，分別位于36～60、73～96、111～130、151～172、220～239、256～276和291～315區(qū)段，符合GPCRs的結構特征。

圖1　目的片段RT-PCR電泳圖Fig.1　Electrophoresis pattern of RT-PCR product注: M: DNA Marker; T: 目的產(chǎn)物Note: M: DNA Marker; T: Target product

圖2　CMKLR1序列分析Fig.2　CMKLR1 sequence analysis注: *:終止子; 下劃線: 跨膜區(qū)段Note: *:Terminator; Underscore: Transmembrane section.

2.3　CMKLR1多序列比對及聚類分析

將牛卵泡CMKLR1全CDS區(qū)序列翻譯為氨基酸序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得其它24種動物對應的氨基酸序列，BLAST分析軟件對序列進行比對。結果表明，該序列與北美野牛序列相似性最高(99.4%)，與其它動物序列相似性為80.0%～96.7%，表明CMKLR1在物種進化過程中保守性較強(圖3)。

圖3　多物種氨基酸序列比對Fig.3　Multi-species amino acid sequence alignment.

基于不同動物(包括偶蹄類、長鼻類、鯨類、靈長類、食肉類和嚙齒類)CMKLR1氨基酸序列聚類分析，應用遺傳距離鄰近法系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)表明，牛(Bostaurus)與北美野牛(Bisonbison)遺傳距離最近，與馬島刺猬(Echinopstelfairi)遺傳距離最遠。

圖4　CMKLR1氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4　Phylogenetic tree based on amino acid sequences of CMKLR1

2.4　牛CMKLR1糖基化和磷酸化位點分析

NetOGlyc 4.0軟件分析表明CMKLR1有4個O-糖基化位點(評分閾值>0.5)，分別為第195位、第196位、第209位和第344位(表1)。

NetNGlyc 1.0分析表明，CMKLR1不存在信號肽，沒有暴露N-糖基化位點的機制存在。預測結果僅提示在第7位可能是潛在的N-糖基化位點(評分閾值>0.5)，第187位評分值較低，形成N-糖基化的可能性較小(表2)。

NetPhos 3.1分析表明：CMKLR1氨基酸序列從6～353位共有50個潛在的磷酸化位點(圖5，評分閾值>0.5)，磷酸化位點的激酶種類包括unsp, EGFR, CKII, CKI, DNAPK, p38MAPK, PKC, PKA, cdc2和CaM-II共10種。大量位點的存在和激酶的多樣性也表明了CMKLR1功能調(diào)節(jié)的復雜性。

表1　CMKLR1 O-糖基化位點預測Table 1　Predicted O-glycosylation of CMKLR1

表2　CMKLR1 N-糖基化位點預測Table 2　Predicted N-glycosylation of CMKLR1

圖5　CMKLR1磷酸化位點預測Fig.5　Predicted phosphorylation of CMKLR1

2.5　牛CMKLR1三級結構預測

由PDB數(shù)據(jù)庫和CDD數(shù)據(jù)庫預測CMKLR1三級結構和功能結構域(圖6)，結果顯示：氨基酸序列36～315之間共形成7個平行排列的螺旋結構(圖6 A)，并7次橫跨胞膜；功能域分析也進一步表明7次跨膜結構(7tm)對CMKLR1功能的決定作用，屬于典型的GPCRs(圖6B)。

圖6　CMKLR1立體結構和功能域預測Fig.6　Predicted 3D structure and functional domains of CMKLR1

3　討論與結論

蛋白質(zhì)糖基化修飾過程對蛋白翻譯、降解、免疫保護以及信號調(diào)控等功能執(zhí)行具有重要意義，如大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子和酶類物質(zhì)均存在翻譯后糖基化修飾[12]；而磷酸化修飾過程對蛋白質(zhì)調(diào)控細胞增殖、發(fā)育、分化以及信號轉(zhuǎn)導等生命活動有關鍵作用，如CDKs(Ser/Thr激酶)通過激活周期蛋白并形成復合物，參與細胞周期調(diào)控[13]，細胞內(nèi)NADPH 氧化酶和電子傳遞鏈相關蛋白均存在磷酸化調(diào)控過程[14]。氨基酸序列結構分析表明，CMKLR1分子中存在4個O-糖基化位點、1個N-糖基化位點和50個磷酸化位點。大量翻譯后修飾位點的存在，保證了CMKLR1在不同器官、組織和細胞中執(zhí)行生物功能時，通過精確的調(diào)控發(fā)揮其多樣化功能。

三級結構和功能域預測分析結果表明，CMKLR1蛋白分子具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族7次跨膜(7tm)結構存在。該結構的特點是空間結構中均有7個跨膜α螺旋，并將蛋白分割為膜內(nèi)C端、膜外N端、3個膜內(nèi)Loop環(huán)和3個膜外Loop環(huán)，且C端和膜內(nèi)Loop環(huán)上均有鳥苷酸環(huán)化酶結合位點[15]。人類β2腎上腺素能受體結構是第一個被揭示的GPCR，并于2011年對其晶體結構成功解析[16，17]。由于GPCRs立體結構在胞膜內(nèi)外都有Loop環(huán)存在，使得其結構的穩(wěn)定性較差。GPCRs結構解析對應用研究意義重大，GPCRs作為藥物靶點設計具有廣泛的應用前景[18]。

CMKLR1作為GPCRs，對蛋白激活和炎性部位趨藥性調(diào)節(jié)具有重要作用[19]。體外試驗和動物在體試驗表明，CMKLR1通過信號傳導調(diào)節(jié)局部炎癥或組織損傷部位細胞CMKLR1的過表達，從而發(fā)揮抗炎作用[19，20]。研究表明，CMKLR1對人和大鼠生殖功能具有調(diào)控作用[21，22]；動物卵泡的生長和分化依賴于促性腺激素、細胞因子和生長因子嚴格調(diào)控以及卵泡GCs、膜細胞和卵母細胞之間的相互調(diào)節(jié)[23]；反之，卵泡細胞之間的相互作用對卵泡的形成和類固醇激素的分泌至關重要[24～26]。Wang等研究表明，長期對老鼠模型雄激素刺激，卵巢和循環(huán)系統(tǒng)的趨化素水平顯著升高，卵泡高水平的CMKLR1會抑制FSH誘導的GCs類固醇激素生成[27]。然而，不同發(fā)育階段牛卵泡CMKLR1的表達模式及其對卵泡發(fā)育的調(diào)控機理仍不清楚，本研究對牛卵泡CMKLR1結構分析和功能預測，為后期深入研究CMKLR1調(diào)控牛卵泡發(fā)育奠定了基礎。