，，，，*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

熱激蛋白(heat shock protein, Hsps)又稱應(yīng)激蛋白或分子伴侶，是細(xì)胞或生物體在遭受生物或非生物脅迫后，表達(dá)量增加或新合成的蛋白質(zhì)[1]，其結(jié)構(gòu)高度保守，主要參與蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、維持蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定及免疫應(yīng)答[2]。Hsps根據(jù)分子量、氨基酸序列和功能可以劃分為五大家族，即小分子熱激蛋白(small heat shock proteins, sHsps)、Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90家族[3]。在HSPs家族中，小分子熱激蛋白是最不保守、極具多樣性的，表現(xiàn)出廣泛的序列變異和進(jìn)化趨異。盡管sHsps在序列和大小上具有多樣化，但絕大數(shù)擁有一些共同的特征。其單體分子量范圍為12～42 kDa之間，主要結(jié)構(gòu)由N末端區(qū)域、C末端區(qū)域及C端延伸區(qū)構(gòu)成，高度保守的C末端有一個約90個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，被稱為α晶體狀結(jié)構(gòu)域(alpha-crystallins domain, ACD)。ACD域的兩側(cè)是由平均55個氨基酸組成的N端和一個C末端(通常<20個氨基酸)構(gòu)成[4,5]。sHsps不僅在脅迫條件下能夠誘導(dǎo)表達(dá)，并且部分sHsps也是生物體中特定的組成成分，其以寡聚體天然狀態(tài)發(fā)揮功能作用，并參與一些重要的細(xì)胞生理活動。作為非依賴ATP的分子伴侶，sHsps是細(xì)胞防御的第一道防線，防止細(xì)胞基質(zhì)中的蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性，尤其是脅迫細(xì)胞的蛋白變性[6,7]。近年來，與其它類型的熱激蛋白相比，對sHsps的結(jié)構(gòu)、功能和運(yùn)行機(jī)制的研究相對較少。有關(guān)昆蟲sHsps的研究，也主要集中在幾種模式昆蟲，這些小分子熱激蛋白在昆蟲的生長發(fā)育、生殖以及滯育等重要生命活動中發(fā)揮重要的作用，同時在抵御脅迫環(huán)境以及適應(yīng)性進(jìn)化中也具有重要意義[8]。

蓮草直胸跳甲(Agasicleshygrophila)，屬鞘翅目Coleoptera，葉甲科Chrysomelidae，原產(chǎn)于南美洲阿根廷，是20世紀(jì)30年代引入我國的全球性惡性雜草—喜旱蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)的專食性天敵昆蟲[9～12]。最新研究表明，隨著全球氣候變暖，喜旱蓮子草和蓮草直胸跳甲在我國均已向高緯度地區(qū)逐漸擴(kuò)散，但喜旱蓮子草的擴(kuò)散面積遠(yuǎn)大于蓮草直胸跳甲，主要原因是蓮草直胸跳甲對環(huán)境的適應(yīng)能力低于喜旱蓮子草[13]。在高緯地區(qū)，低溫限制了蓮草直胸跳甲的分布北界。在低緯度地區(qū)，蓮草直胸跳甲種群隨季節(jié)變化，消長明顯。溫度是影響昆蟲種群數(shù)量和地理分布的重要因素[14]。在自然界中昆蟲經(jīng)常面臨冷或熱的溫度脅迫，經(jīng)過長期的進(jìn)化適應(yīng)，昆蟲自身也發(fā)展出了多種生理和生化上的應(yīng)對策略。熱激蛋白基因是與昆蟲溫度適應(yīng)最為密切的基因之一，熱激蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)也是昆蟲在極端溫度下適應(yīng)、生存所必須的[14,15]。近年來研究也發(fā)現(xiàn)，sHsps的表達(dá)可以提高昆蟲的溫度耐受性[14]，但關(guān)于蓮草直胸跳甲sHsps的研究還未見報道。

本研究基于實(shí)驗(yàn)室已完成的蓮草直胸跳甲PacBio SMRT測序數(shù)據(jù)[16]，克隆鑒定了一條帶有完整開放閱讀框的sHsp基因，根據(jù)其蛋白質(zhì)的分子量大小命名為sHsp20.8，然后對其序列特征、理化性質(zhì)及系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。為深入研究小分子熱激蛋白基因的功能，探討蓮草直胸跳甲對環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　研究材料

蓮草直胸跳甲：采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)(中國，廣州)，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)蟲室(山西，太谷)，標(biāo)準(zhǔn)化條件(25 ℃±1℃，L∶D=14∶10，RH=85%±5%)下多代飼養(yǎng)，使之成為遺傳背景較一致的試驗(yàn)種群。

喜旱蓮子草：采自浙江省玉環(huán)縣，現(xiàn)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治研究基地溫室中。

1.2　sHsp20.8基因的克隆鑒定及測序

通過蓮草直胸跳甲PacBio SMRT測序數(shù)據(jù)篩選sHsp20.8相關(guān)序列，然后使用Vector NTI軟件對sHsp20.8的EST序列群進(jìn)行拼接組裝，獲得完整的sHsp20.8基因序列。根據(jù)完整序列利用Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計引物：sHsp20.8-F(TCCACAGATGGTGTGCTGTC)和sHsp20.8-R(CCGATTTAGCTGGTTCTCCA)。蓮草直胸跳甲的總RNA的提取，通過PT-PCR擴(kuò)增sHsp20.8序列，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；共35個循環(huán)；之后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD20-T載體，挑取陽性克隆送上海生工測序驗(yàn)證。

1.3　sHsp20.8基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

采用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測sHsp20.8基因的開放閱讀框ORF。再經(jīng)BLASTp相似性搜索，采用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行多序列比對。通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對sHsp20.8基因編碼蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。并用MOTIF(http://www.genome.jp/tools/motif/)預(yù)測其motif。再通過ExPASy-ProtParam tool程序(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測分析該基因編碼蛋白序列的基本理化性質(zhì)。同時還采用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測sHsp20.8蛋白的親/疏水性。SignalP 4.1 Setver(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析sHsp20.8蛋白的信號肽[17]。亞細(xì)胞定位采用PSORT II(https://psort.hgc.jp/form2.html)。再用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測sHsp20.8蛋白跨膜區(qū)。

蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，采用在線SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)。用ProtFun 2.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)預(yù)測其蛋白的功能。使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index)在線軟件對蓮草直胸跳甲sHsp20.8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。再使用MEGA7.0軟件，選擇鄰接法(neighbor-joining method, NJ)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析其系統(tǒng)發(fā)育。

2　結(jié)果與分析

2.1　sHsp20.8基因及編碼的蛋白序列

通過序列拼接及進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，得到蓮草直胸跳甲一條完整CDS，經(jīng)ORF finder分析，該序列包含一個543 bp的完整ORF，編碼180個氨基酸(圖1)。序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在C端含有小分子熱激蛋白典型的α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(alpha-crystallin domain, ACD)，該結(jié)構(gòu)域是小分子熱激蛋白家族進(jìn)化上保守的標(biāo)志，也是行使其功能所必要的結(jié)構(gòu)。另外在C-末端延伸的保守區(qū)存在1個“I/L-X-I/L”的保守特征基序(圖2)。通過BLASTp相似性搜索和同源性比較發(fā)現(xiàn)，蓮草直胸跳甲sHsp20.8氨基酸序列與其它昆蟲有著較高的相似性，尤其在α晶體蛋白結(jié)域。

2.2　sHsp20.8的保守結(jié)構(gòu)域分析及motif預(yù)測

通過SMATR分析蓮草直胸跳甲sHsp20.8蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)功能域，結(jié)果顯示該蛋白在第67～162區(qū)域，包含Hsp20家族的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。使用MOTIF在線程序(選擇Pfam和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫)預(yù)測顯示，所有比對上的motif在65～162區(qū)域內(nèi)均含有Hsp20/alpha crystallin family保守結(jié)構(gòu)域。以上結(jié)果均表明，本研究所克隆的sHsp20.8屬于Hsp20家族，并且獲得該基因的完整序列。

圖3　蓮草直胸跳甲sHsp20.8保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3　The analysis of conserved domain of A. hygophila sHsp20.8

2.3　sHsp20.8的理化性質(zhì)及疏水性分析

ProParam對sHsp20.8基因所編碼的180個氨基酸預(yù)測結(jié)果顯示，sHsp20.8的分子量為20.8 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.45，分子式為C920H1460N262O283S5，總共包括2 930個原子。在組成sHsp20.8蛋白的20種氨基酸中，相對含量較高的氨基酸有Glu(17個，9.4%)、Lys(16個，8.9%)、Leu(14個，7.8%)、Thr(13個，7.2%)，而半胱氨酸(Cys)所占比例最低，僅為0.6%，不含有色氨酸Trp。帶正電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)為28個，負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp + Glu)為30個。不穩(wěn)定指數(shù)為45.35，根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白，推測sHsp20.8蛋白是不穩(wěn)定的。脂肪系數(shù)為74.17，表明蓮草直胸跳甲sHsp20.8蛋白熱穩(wěn)定性良好。ProtScale(Hphob./Kyte & Doolittle)疏水性結(jié)果顯示(圖4)，該蛋白親水性最大值為-3.522，疏水性最大值為1.289，其中親水氨基酸含量較多，約占84.88%。sHsp20.8蛋白的總親水平均值為-0.846，結(jié)果表明該蛋白是可溶性蛋白質(zhì)。

圖4　蓮草直胸跳甲sHsp20.8氨基酸疏水性/親水性預(yù)測Fig.4　Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of A. hygrophila sHsp20.8

2.4　sHsp20.8的信號肽、亞細(xì)胞定位及跨膜分析

使用SignalP 4.1 Setver在線預(yù)測蓮草直胸跳甲sHsp20.8蛋白的信號肽,結(jié)果顯示mean S -Value為0.112，依據(jù)其大于0.5則判斷為分泌蛋白，說明sHsp20.8蛋白不具有信號肽，不是分泌蛋白。PSORT II亞細(xì)胞定位預(yù)測也表明sHsp20.8蛋白定位于細(xì)胞核中。TMHMM跨膜預(yù)測顯示sHsp20.8蛋白不含跨膜區(qū)。以上預(yù)測結(jié)果均表明，該蛋白可能主要在細(xì)胞核中防止蛋白發(fā)生不可逆的變性，從而使細(xì)胞免受不可逆的蛋白聚集導(dǎo)致?lián)p傷。

2.5　sHsp20.8的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

使用SOPMA軟件對蓮草直胸跳甲sHsp20.8蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖5)顯示，該蛋白質(zhì)是由56.11%的無規(guī)則卷曲(Cc)，23.89%的α螺旋(Hh)，16.11%的β折疊(Ee)和3.89%的β轉(zhuǎn)角(Tt)組成的。雖然4種結(jié)構(gòu)類型貫穿于整條氨基酸鏈，但其中α螺旋和無規(guī)則卷曲是其主要的構(gòu)成元件，β轉(zhuǎn)角含量相對較少，僅零散分布于其中。ProtFun軟件對sHsp20.8蛋白的功能分類預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白具有酶活性。功能類別(functional category)顯示該蛋白可能有運(yùn)輸和結(jié)合功能，與小分子熱激蛋白抑制蛋白變性、促進(jìn)蛋白折疊等特性較為符合。

圖5　sHsp20.8的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5　Secondary structure prediction of sHsp20.8注：A. α螺旋；B. 無規(guī)卷曲；C. β折疊；D. β轉(zhuǎn)角。　　Note:A. Alpha helix；B. Random coil；C. Extend strand；D. Beta turn.

2.6　sHsp20.8的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用在線工具Phyre2進(jìn)行sHsp20.8蛋白三級結(jié)構(gòu)的同源建模，使用PyMOL三級結(jié)構(gòu)顯示軟件分析sHsp20.8蛋白同源建模結(jié)果(圖6)?？梢郧宄膮^(qū)分出該蛋白N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，其C末端有一個α晶體狀結(jié)構(gòu)域(ACD)，6個反向平行β鏈形成的β夾層結(jié)構(gòu)(β-sandwich)也主要集中于此。盡管sHsps序列間的保守性較低，但ACD的β夾層仍然是sHsps家族進(jìn)化上保守的標(biāo)志[5]。N端主要為α螺旋結(jié)構(gòu)，能調(diào)節(jié)小分子熱激蛋白形成多聚復(fù)合物。N端保守性較低，僅在密切相關(guān)的物種之間發(fā)現(xiàn)N末端序列具有保守性。

圖6　蓮草直胸跳甲sHsp20.8的三級結(jié)構(gòu)Fig.6　Tertiary structure of A. hygrophila sHsp20.8　　注：黃色表示蓮草直胸跳甲sHsp20.8的α晶體狀結(jié)構(gòu)域；藍(lán)色表示其特征基序(數(shù)字表示氨基酸位置)?！　ote:The yellow color indicates the alpha-crystallin domain of A. hygrophila sHsp20.8；the blue color indicates the conserved motif(the number indicates the position of amino acids).

2.7　系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA7.0軟件對5個目28種昆蟲的33個sHsps氨基酸序列進(jìn)行多序列比對。使用鄰接法，重復(fù)1 000次，構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)進(jìn)化樹，圖中框出的為蓮草直胸跳甲的sHsp20.8。圖7結(jié)果顯示，蓮草直胸跳甲sHsp20.8與花絨堅甲(Dastarcushelophoroides)、稻象甲(Lissorhoptrusoryzophilus)的sHsps親緣關(guān)系最近聚為一支，與其他鞘翅目昆蟲也共同聚為一支。5個目的昆蟲都能各自分開聚類，符合昆蟲分類學(xué)上的親緣關(guān)系，表明sHsps蛋白也具有物種特異性，可以用于昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖7　蓮草直胸跳甲sHsp20.8和其他昆蟲同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7　Phylogenetic tree of A. hygrophila sHsp20.8 and homologous proteins from other insect species based on the amino acid sequences　　注：GenBank登錄號?！　ote:GenBank accession number: 1) A. pernyi (Antheraea pernyi) ApsHSP21: AFQ02692.1; 2) S.litura (Spodoptera litura) SlsHSP: ADK55522.1; 3) S. nonagrioides (Sesamia nonagrioides) SnsHSP20.8: ABC68342.2; 4) B.mori (Bombyx mori) BmsHSP20.4: NP_001037038.1; 5) C. suppressalis (Chilo suppressalis) CssHSP19.7: BAE94664.1; 6) C. pomonella (Cydia pomonella) CpsHSP22.2: ADX96002.1; 7) P. xylostella (Plutella xylostella) PxsHSP19.5: BAE48744.1; 8) D. plexippus (Danaus plexippus) DpsHSP22.2: OWR51030.1; 9) A. yamamai (Antheraea yamamai) AysHSP: AGY56063.1; 10) C. pomonella (Cydia pomonella) CpsHSP19.9: ADX96001.1; 11)M. brassicae (Mamestra brassicae) MbsHSP20.7: BAF03557.1; 12) B.tabaci (Bemisia tabaci) BtsHSP20: ADG03467.1; 13)T.vaporariorum (Trialeurodes vaporariorum) TvsHSP20: ACH85200.1; 14)T. vaporariorum (Trialeurodes vaporariorum) TvsHSP: ACI15853.1; 15) L. sativae (Liriomyza sativae) LssHSP20.8: ABE57141.1; 16) L. huidobrensis (Liriomyza huidobrensis) LhsHSP20: ABE57137.1; 17) L. sativae (Liriomyza sativae) LssHSP21.3: ABE57138.1; 18) D. antiqua (Delia antiqua) DasHSP23: ADX36150.1; 19) D. melanogaster (Drosophila melanogaster) DmsHSP23: AAL28629.1; 20) G. morsitans morsitans (Glossina morsitans morsitans) GmmsHSP23: ADD18977.1; 21) D. triauraria (Drosophila triauraria) DtsHSP27: AEB54706.1; 22) G. morsitans morsitans (Glossina morsitans morsitans) GmmsHSP: ADD18487.1; 23) D. ponderosae (Dendroctonus ponderosae) DpsHSP27-like: XP_019759317.1; 24) T. castaneum (Tribolium castaneum) TcsHSP21: XP_974367.1; 25) T. castaneum (Tribolium castaneum) TcsHSP23: XP_973344.1; 26) C. bowringi (Colaphellus bowringi) CbsHSP21: AMK38872.1; 27) G. atrocyanea (Gastrophysa atrocyanea) GasHSP21: BAD91164.1; 28) G. daurica (Galeruca daurica) GdsHSP20.6: ATY47553.1; 29) A. hygrophila (Agasicles hygrophila) AhsHSP20.8: 30) D. helophoroides (Dastarcus helophoroides) DhsHSP: ANA11235.1; 31) L. oryzophilus (Lissorhoptrus oryzophilus) LosHSP: AHE77375.1; 32) A. gambiae (Anopheles gambiae) AgsHSP: AAG15376.1; 33) L. migratoria (Locusta migratoria) LmsHSP20.6: ABC84493.1.

3　討論與結(jié)論

本研究從蓮草直胸跳甲中克隆獲得了一條包含完整開放閱讀框的小分子熱激蛋白sHsp20.8基因。發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列含有小分子熱激蛋白保守的α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域，含有典型的“I/L-X-I/L”保守特征基序，有研究表明該特征基序有助于驅(qū)動大寡聚體的裝配[18]。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境的脅迫時，部分變性的蛋白質(zhì)結(jié)合至sHsps的寡聚體上，使細(xì)胞免受不可逆蛋白聚集而導(dǎo)致的損傷；脅迫消失時，復(fù)合物解體，在ATP需能伴侶如Hsp70的幫助下重新折疊成正確的空間構(gòu)象，從而發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能[19,20]。與大分子熱激蛋白相比，盡管小分子熱激蛋白表現(xiàn)出較大的序列變異和進(jìn)化趨異，但本研究對5個目28種昆蟲的33個sHsps系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，各目昆蟲的sHsps可以單獨(dú)聚類，進(jìn)一步說明小分子熱激蛋白基因也可以作為昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析的標(biāo)志基因。

小分子熱激蛋白(sHsps)的分布較廣泛，在微生物、植物和動物中都有分布，同時也是分子量最小，保守性最低的一類熱激蛋白。目前對于sHsps雖然研究不是特別深入，但已引起研究者的廣泛關(guān)注。sHsps生物功能多樣，大多數(shù)時候以寡聚體天然狀態(tài)存在和發(fā)揮功能作用，當(dāng)其作為分子伴侶時，通過磷酸化或去磷酸化的修飾來調(diào)節(jié)寡聚體的大小和狀態(tài)，進(jìn)而形成不同的寡聚體結(jié)合不同的底物蛋白[21,22]。研究表明，sHsps可以增強(qiáng)生物體對環(huán)境脅迫的耐受和恢復(fù)能力，并輔助變性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)重新組裝，保持蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和生理功能[23]。如通過RNAi敲除果蠅sHsp22和sHsp23則中斷了果蠅在寒冷傷害后的恢復(fù)進(jìn)程[24]；水稻大螟Sesamiainferens經(jīng)過高溫脅迫，sHsp19.6和sHsp20.6的mRNA水平顯著上調(diào)，它們在其適應(yīng)環(huán)境變化中發(fā)揮重要作用[25]。在昆蟲中也鑒定出了多種功能不同的sHsps，這些sHsps在昆蟲的生長發(fā)育、滯育及溫度適應(yīng)性中可能發(fā)揮重要作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，家蠶Bombyxmori在滯育階段代謝活動明顯下降，但在其胚胎滯育期sHsp20.8表達(dá)上調(diào)[26]；蛀莖夜蛾Sesamianonagrioides滯育幼蟲中sHsp19.5表達(dá)穩(wěn)定，而sHsp20.8先下調(diào)，在滯育終止時上調(diào)，參與了其滯育調(diào)控[27]。此外，sHsps調(diào)控發(fā)育的現(xiàn)象，在植物和動物的生殖和胚胎組織中都有所發(fā)現(xiàn)[28]。總之，sHsps可以參與生物體生長發(fā)育的調(diào)控和脅迫等應(yīng)激反應(yīng)。但這些研究主要集中在基因的表達(dá)模式水平，因此要想全面認(rèn)識sHsps的功能作用，還需有效結(jié)合多種試驗(yàn)技術(shù)并更新試驗(yàn)方法。

本研究成功克隆了蓮草直胸跳甲sHsp20.8基因，為深入研究sHsps在蓮草直胸跳甲生長發(fā)育、溫度適應(yīng)性中的功能作用及分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時也對蓮草直胸跳甲生物防治喜旱蓮子草的方針策略具有重要指導(dǎo)意義。