楊新宇　李波　趙琰楓　王嫩寒　張潔　易俊莉　田麗麗　任怡宣 樊瑞芳　趙文娟　陳昊　陳雙雙　代小偉　丁北川

實驗室診斷是結核病診斷、治療及預防控制過程中所必需的。結核病實驗室檢查尤其是細菌學檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，是確診結核病和選擇治療方案的主要依據(jù)，也是考核療效、評價防治效果的可靠標準。細菌學檢驗結果的準確性首先取決于標本的質量[1]。正確地采集、留取標本是直接影響檢驗結果的重要因素和取得準確結果的前提[2]。世界衛(wèi)生組織在《2017年全球結核病報告》[3]中指出，2016年在世界范圍內約有1040萬例結核病新發(fā)患者，發(fā)現(xiàn)并得到正式報告的僅為630萬例，留下的缺口有410萬例。結核病患者漏診和漏報問題仍然是一個挑戰(zhàn)，痰液檢查是診斷肺結核的重要手段，如未能及時留取合格的痰標本，將會延誤患者的診斷和治療[4]。筆者收集了2016年至2017年在北京結核病控制研究所初診并最終被確診為肺結核的564例患者的1692份痰標本，分析痰標本質量對分枝桿菌涂片、培養(yǎng)結果的影響，為臨床診斷、治療工作提供參考。

資料和方法

一、研究對象及診斷標準

1．研究對象：收集2016年1月至2017年12月初次就診于北京結核病控制研究所門診部，并最終被診斷為肺結核的564例患者。每例患者初診時留取3份痰標本進行細菌學檢查，包括3份抗酸染色涂片檢查，并選擇其中2份性狀較好的痰標本同時做分枝桿菌培養(yǎng)；培養(yǎng)項目根據(jù)患者的病情、需求及經濟能力進行選擇[固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)(BACTEC MGIT 960)]。

2．資料來源：以實驗室檢查為主，結合胸部影像學檢查和患者的臨床表現(xiàn)，以及必要的輔助檢查和鑒別診斷，綜合分析后確診為肺結核患者的痰標本。

3．診斷標準：按照《WS 288—2008 肺結核診斷標準》,肺結核分確診患者、臨床診斷患者和疑似患者。本研究僅討論確診患者和臨床診斷患者。

確診患者診斷標準：(1)痰涂片陽性肺結核。①2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；②1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+胸部影像學檢查有與活動性肺結核相符的病變；③1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰分枝桿菌培養(yǎng)陽性。(2)僅分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性+胸部影像學檢查有與活動性肺結核相符的病變。(3)肺組織病理學檢查符合結核病病理改變。

臨床診斷患者：3次痰涂片均為陰性，胸部影像學檢查有與活動性肺結核相符的病變，并伴以下任一條：(1)臨床有肺結核可疑癥狀；(2)結核菌素試驗強陽性；(3)結核抗體檢查陽性；(4)肺外組織活檢病理診斷為結核病變；(5)疑似肺結核患者經診斷性治療或隨訪觀察可排除其他肺部疾病者[5]。

二、試劑及方法

1．試劑：萋-尼抗酸染色液，酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術有限公司提供，BACTEC MGIT 960 分枝桿菌培養(yǎng)管由美國BD公司提供。

2．痰涂片檢測方法及分級報告標準：痰涂片鏡檢采用萋-尼染色，按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[6](簡稱《規(guī)程》)進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢。鏡檢結果分級報告結果：(1)萋-尼染色抗酸桿菌陰性，即連續(xù)觀察 300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；(2)萋-尼染色抗酸桿菌陽性，即抗酸桿菌菌數(shù)為1～8條/300個視野；(3)萋-尼染色抗酸桿菌陽性“+”，即3～9條/100個視野，連續(xù)觀察300個視野；(4)萋-尼染色抗酸桿菌陽性“++”，即1～9條/10個視野，連續(xù)觀察100個視野；(5)萋-尼染色抗酸桿菌陽性“+++”，即1～9條/視野；(6)萋-尼染色抗酸桿菌陽性“++++”，即≥10條/視野[6]。統(tǒng)計學計算時根據(jù)菌量，分為“1～8條/300個視野、+和++、+++和++++”3個數(shù)量等級進行比較。

3．痰培養(yǎng)檢測方法及分級結果判讀：分枝桿菌固體培養(yǎng)采用簡單法，液體培養(yǎng)采用中和離心法。按照《規(guī)程》進行分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查。分級結果判讀：(1)無菌落生長報告為培養(yǎng)陰性；(2)菌落生長不及斜面1/4時，則報告實際菌落數(shù)；(3)菌落占斜面面積1/4時報告“+”；(4)菌落占斜面面積1/2時報告“++”；(5)菌落占斜面面積3/4時報告“+++”；(6)菌落布滿培養(yǎng)基斜面報告“++++”。固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的陽性培養(yǎng)物均需經涂片顯微鏡檢查確定為抗酸桿菌后方可報告[6]。統(tǒng)計學計算時根據(jù)菌量，將報告分為“實際菌落數(shù)、+和++、+++和++++”3個數(shù)量等級進行比較。

4．痰性狀分類標準：(1)干酪痰。標本外觀以黃色或奶酪色、膿樣、團塊狀的肺泡分泌物為主，稠度較黏液痰低，制片時較易涂抹。(2)血痰。此類標本是在黏液痰或干酪痰標本中混有血液，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲。(3)黏液痰。標本外觀以白色、黏稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主。干酪痰、血痰及黏液痰為合格標本。(4)唾液。目視觀察標本整體外觀，以透明或半透明水樣、黏稠度較低的口腔分泌物為主，標本中有時伴有氣泡；由于唾液標本進行抗酸桿菌檢查時的檢出率很低，在患者確定診斷時為不合格標本[6]。

5．質量控制：按照《規(guī)程》要求，進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)的室內質量控制及室間質量評價[6]。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

一、初診肺結核患者3份痰標本性狀分析

564例初診肺結核患者中，確診患者242例，占42.9%(242/564)。3份痰標本均合格者311例，占55.1%(311/564)；3份標本均合格的患者中，確診患者占51.4%(160/311)。3份標本均不合格者118例，占20.9%(118/564)；其中確診患者占22.9%(27/118)(表1)。3份痰標本均合格者細菌學檢查確診為肺結核患者的比率是3份均不合格痰標本者的2.2倍(51.4/22.9)。

二、不同檢測方法在合格痰標本和不合格痰標本中的陽性分布情況

564例初診肺結核患者共收集1692份痰標本，其中痰涂片檢查1692份，固體培養(yǎng)檢查992份，液體培養(yǎng)檢查136份。 1692份痰標本中，合格者1138份，合格率67.3%；初診肺結核中合格痰標本涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)陽性率分別為21.1%、37.4%和68.0%(表2)。不合格痰標本涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)陽性率分別為3.4%、16.2%和27.8%；經統(tǒng)計學分析，涂片、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的陽性率在合格痰標本和不合格痰標本中差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為89.637、44.037、17.509，P值均<0.001)。不論是合格標本還是不合格標本，液體培養(yǎng)的陽性率均明顯高于固體培養(yǎng)(表3)；在564例初診肺結核患者中，有124例患者同時進行了固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)的陽性率為40.3%(50/124),液體培養(yǎng)的陽性率為56.5%(70/124)。

三、初診肺結核患者不同性狀陽性痰標本在涂片、固體培養(yǎng)檢查中量化分級結果比較

1692份痰標本中共檢出陽性涂片259份，合格痰標本陽性涂片主要分布在“+和++”，不合格痰標本陽性涂片主要集中在“1～8條”及“+和++”。不同痰性狀的標本，涂片陽性結果在不同量化分級標本間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.99，P=0.016)(表4)。 992份痰標本中用固體培養(yǎng)法共檢出陽性標本307份，合格痰標本固體培養(yǎng)陽性者在不同分級標本中呈較平均分布，不合格痰標本的陽性者主要集中在“+”以下；不同痰性狀的標本，培養(yǎng)陽性結果在不同量化分級標本間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.05，P<0.001)(表5)。

表1　不同診斷分類肺結核初診患者在各類3份痰標本組合中的分布(例)

表2　1138份不同性狀合格痰標本采用3種技術進行檢測的結果分析

注部分標本總份數(shù)不到30份，計算陽性率差異無統(tǒng)計學意義，故陽性率不做統(tǒng)計

表3　不同檢測技術對合格與不合格痰標本的檢測陽性率比較

表4　不同涂片量化分級標本在合格與不合格痰標本中涂片陽性結果的比較

表5　不同培養(yǎng)量化分級標本在合格與不合格痰標本中固體培養(yǎng)陽性結果的比較

討　　論

《WS 288—2017 肺結核診斷》[7]標準已于2018年5月1日實施，病原學診斷是肺結核診斷的金標準。檢驗結果正確與否關鍵在于質量保證體系，質量保證體系分為分析前、分析中和分析后的質量控制。導致臨床實驗室檢驗結果出現(xiàn)差錯，多數(shù)在分析前或分析后階段[8]。在實驗誤差中，分析前誤差約占70%，因此分析前質量保證是臨床實驗室質量保證體系中最關鍵的環(huán)節(jié)之一，是確保檢驗信息正確有效的先決條件[9-10]。而微生物實驗室分析前質量失控的主要原因是臨床送檢標本不合格[11]。

《“十三五”全國結核病防治規(guī)劃》明確提出，到2020年肺結核患者病原學陽性率要達到50%以上[12]，2016—2017年我研究所細菌學檢查陽性率為42.9%，距離“十三五”要求還有一定差距。任何病原學檢查項目，合格痰標本的留取對于檢查結果的影響都至關重要。通過比較發(fā)現(xiàn)，無論是涂片結果還是培養(yǎng)結果，合格痰標本(干酪痰、血痰、黏液痰)的陽性檢出率及量化分級指標均遠遠高于不合格標本(唾液)，差異有統(tǒng)計學意義；在259份抗酸桿菌涂片陽性的痰標本中不合格標本(唾液)占19份，陽性檢出率極低，僅為3.4%；不合格標本在分枝桿菌培養(yǎng)檢查中不但陽性率低，而且在陽性量化分級中主要集中在菌量較小的“+”以下；3份痰標本均合格者細菌學檢查確診為肺結核患者的比率是3份均不合格痰標本者的2.2倍；痰涂片陽性率和痰培養(yǎng)陽性率隨痰質量的提高而增加，差異有統(tǒng)計學意義；說明了痰標本質量在肺結核診斷中的重要性[13]。采用液體培養(yǎng)法進行處理的痰標本，無論是合格痰標本還是不合格痰標本，陽性率均明顯高于固體培養(yǎng)，即使唾液標本檢測陽性率還是比較低(27.8%)，但是也已遠遠超過其在固體培養(yǎng)中的陽性率(16.2%)；對于相同研究對象(同時進行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的124例患者)液體培養(yǎng)的陽性率提高了16.2%。張娟等[14]也報道，全自動MGIT 960液體培養(yǎng)方法的敏感度和特異度均高于羅氏固體培養(yǎng)法，分析認為固體培養(yǎng)對于痰標本的前處理采用的是4%氫氧化鈉，而液體培養(yǎng)前處理采用的是2%氫氧化鈉，在控制好污染率的同時縮短了分枝桿菌的陽性報告時間[15]；由于液體培養(yǎng)的前處理液采用的是較低濃度氫氧化鈉處理痰標本，以及離心集菌的前處理方法，因而增加了對菌量較少標本的陽性檢出率。故筆者推薦實驗室分枝桿菌分離培養(yǎng)盡可能采用液體培養(yǎng)的方法，以提高陽性率。另外，對于痰液性狀的判斷，每個檢驗者主觀認識有差異，單純用干酪痰、血痰、黏液痰、唾液區(qū)分不能客觀地反映痰標本是否合格，合格的痰標本為平均每低倍鏡視野里鱗狀上皮細胞應小于10個，白細胞數(shù)應大于25個，痰標本白細胞數(shù)是診斷肺結核痰標本可接受的一個指標[16]。因此，筆者認為用量化細胞數(shù)更能反映痰標本是否合格，建議將標本性狀和細胞數(shù)一同報告在結果中，為臨床提供可靠的參考依據(jù)。

北京市按照《北京市結核病防治規(guī)劃(2011—2015年)》[17]的要求切實加強肺結核患者的發(fā)現(xiàn)力度，強調了綜合醫(yī)療機構與結核病防治機構(簡稱“結防機構”)合作的重要性，開展結核病“醫(yī)防合作”的防治模式[18]，通過加強對密切接觸者篩查、新生入學體檢等措施，重視和加強主動發(fā)現(xiàn)策略，穩(wěn)步推進結核病“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”[19]。因此推測，由于許多肺結核患者是在發(fā)病早期或者沒有臨床癥狀的階段被發(fā)現(xiàn)，導致患者的痰標本性狀不容易達到合格的要求。本研究顯示，在564例肺結核患者1692份痰標本中，3份標本均合格者占55.1%(311/564)，2份標本合格者占12.4%(70/564), 1份標本合格者占11.5%(65/564),3份標本均不合格者占20.9%(118/564)。在肺結核患者的3份痰標本中，有23.9%的患者留出過合格的痰標本，說明即使留取困難，這部分患者仍然有可能留出合格的痰標本。

《國際醫(yī)學實驗室認可準則》明確要求要監(jiān)測檢驗全程(TTP)的質量。目前，分析階段的誤差得到了有效控制；而分析前、后階段的誤差成為影響質量的主要因素。因而,監(jiān)測與改善分析階段外的質量將是我們面臨的任務[20]。通過加強醫(yī)生-護士-患者的合作，用有效數(shù)據(jù)直接與患者進行溝通，強調痰標本質量對于檢出率的重要性，強調合格痰標本是來自支氣管或肺深部的膿樣、干酪樣或黏液樣痰液，痰量不少于3 ml；用發(fā)放宣傳卡片、觀看視頻等方式進行有效的宣傳教育(簡稱“宣教”)。宣傳資料的詞句盡可能減少使用過于專業(yè)的詞匯，做到簡單易懂；對痰少不能咳出者，指導其有效咳嗽排痰的技巧，可采用背部叩擊法誘導排痰[21]；對無咳嗽、無痰患者，醫(yī)生可開醫(yī)囑給予2.5%氯化鈉霧化吸入導痰[22]；必要時與患者家屬溝通，幫助和指導患者采用正確的方式采集標本,切實提高患者留取合格痰標本的比例。

綜上所述，本研究初診肺結核患者痰標本的留取合格率較低，應加強對患者的宣教力度，充分說明痰標本質量對檢查結果的重要性，并采取切實有效的指導和措施，保證分析前留取痰液的質量控制；鑒于液體培養(yǎng)的敏感度及特異度均較高，有能力的實驗室應積極開展液體培養(yǎng)，以提高分枝桿菌檢出陽性率，從而保證肺結核診斷的準確性。