張熙桐，李墨翰，吳尚，吳尚儀，韓宏嬌，孔繁華，岳喜慶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

羊乳是由健康乳羊分泌的脂肪含量高于2.5%、非脂乳固體含量高于7.5%的正常乳汁(不包括初乳)。羊乳中富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、礦物質(zhì)以及多種維生素，其基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和各項營養(yǎng)元素配比均與人乳相類似，有“白色血液”之稱。羊乳獨特的營養(yǎng)價值和風(fēng)味，已成為西方發(fā)達國家日常生活的必須消費品，并使用羊乳配方奶粉替代母乳，羊乳市場占有率高達80%[1,2]。羊乳和牛乳一樣富含營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)[3]，與牛乳相比，羊乳具有蛋白質(zhì)凝塊軟且小、易消化吸收、乳糖不耐癥發(fā)生率低、與人乳更接近等優(yōu)點[4]。

乳清蛋白是乳在適當(dāng)?shù)臏囟燃暗入婞c的情況下，經(jīng)過酸化沉淀以后分離出來的物質(zhì)[5]。乳清蛋白必需氨基酸種類齊全，組成模式與人體相似，容易消化吸收，具有極高的生物利用效價；乳清蛋白功能多樣，來源于天然食品，是可獲得的最經(jīng)濟的食物蛋白質(zhì)資源之一[6～8]?？梢匝a充人體所需要的氨基酸，提高機體抗氧化能力，保護免疫細胞減輕疲勞[9]。近年來，國內(nèi)外對乳清蛋白的組成及功能的研究多集中在人乳與牛乳，對羊乳乳清蛋白組成及功能的研究甚少，且多集中于單一種類乳的分析，很少進行多種乳的橫向?qū)Ρ取?/p>

本研究將人乳、牛乳及羊乳中的乳清蛋白進行分離，經(jīng)過酶解后進行質(zhì)譜鑒定，將鑒定后的結(jié)果通過基因本體（gene ontolpgy，GO）功能注釋以及京都基因與基因組百科全書系統(tǒng)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路分析，在重點研究羊乳的基礎(chǔ)上，深入探究羊乳與人乳、牛乳乳清蛋白的組成及功能的區(qū)別，以期為羊乳的進一步研究和開發(fā)提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳、羊乳：均采集自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧場。

采集 30份健康奶牛、奶羊的乳汁低溫運回實驗室，并在實驗前進行混合（防止個體差異）。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏。

人乳：采集某醫(yī)院正常生產(chǎn)、身體健康、頭胎、飲食正常的30位授乳母親的乳汁低溫運回實驗室，并在實驗前進行混合（防止個體差異）。除當(dāng)天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于-80 ℃冰柜冷藏。由授乳母親自愿提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-21G高速冷凍離心機，日本日立公司；真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；毛細管高效液相色譜，美國Agilent公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳清蛋白的提取[10,11]

取人乳、牛乳、羊乳各50 mL，在4 ℃，6000 r/min下離心20 min，去除乳脂層，再置于15000 r/min下離心60 min，獲得乳清部分，除去酪蛋白，置入真空冷凍干燥機制得凍干粉。

1.3.2 FASP酶解[12,13]

量取三種樣品各20 μL，倒入等量的DTT中，得到濃度為100 mM的混合液，在開水中加熱5 min，然后轉(zhuǎn)移到常溫環(huán)境下，添加 20 μL UA buffer（8 M Urea，150 mM TrisHCl pH 8.0）達到均勻狀態(tài)后，轉(zhuǎn)移到10 ku超濾離心管中，離心14000 r/min 15 min。添加200 μL UA buffer離心14000 r/min 15 min，倒掉濾液。添加 100 μL IAA（50 mM IAA in UA），600 r/min振蕩1 min，在無光室溫環(huán)境下靜置30 min，離心14000 r/min 10 min。添加100 μL UA buffer，離心 14000 r/min 10 min 2次。添加100 μL (NH4)2CO3buffer，離心14000 r/min、10 min 2 次。添加 40 μL Trypsin buffer（4 μg Trypsin in 40 μL (NH4)2CO3buffer），600 r/min 混合 1 min，37 ℃ 16～18 h。倒入新收集管中，離心 14000 r/min 10 min，單獨放置濾液。

1.3.3 毛細管高效液相色譜[14,15]

通過納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC予以分離。緩沖液：A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱通過95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到上樣柱 Thermo scientific EASY column(2 cm×100 μm 5 μm-C18)，然后通過分析柱Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm 3 μm-C18)分離，流速為250 nL/min。液相梯度為：0～50 min，B液線性梯度從0%到50%；50～54 min，B液線性梯度從50%到100%；54～60 min，B液保持100%不變。

1.3.4 ESI質(zhì)譜鑒定[16,17]

樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用 Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進行質(zhì)譜分析。分析時長：60 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800m/z，一級質(zhì)譜分辨率：70,000 atm/z200，AGC target：3e6，一級 Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges：1，Dynamic exclusion：15.0 s。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集10個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：2m/z，二級質(zhì)譜分辨率：17,500 atm/z200，Microscans：1，二級 Maximum IT：60 ms，Normalizedcollision energy：27 eV，Underfill ratio：0.1%。

1.3.5 ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析[18]

利用 MaxQuant軟件對原始文件展開數(shù)據(jù)庫檢索。具體參數(shù)為：enzyme為Trypsin；missed cleavage設(shè)為2；靜態(tài)修飾選擇Carbamidomethy C；動態(tài)修飾選擇Oxidation M、Acetyl (Protein N-term)。Peptides FDR＜0.01，Protein FDR＜0.01。

1.3.6 GO功能分析及 KEGG代謝通路分析[19～21]

以上實驗操作進行三次重復(fù)，對于鑒定到的蛋白，選取其中被鑒定到兩次及以上的蛋白進行分析。GO數(shù)據(jù)庫提供生物過程、分子功能和細胞組成三大類功能信息。通過DAVID Bioinformatics Resources在線工具展開數(shù)據(jù)庫查詢及檢索，獲取 GO功能信息和KEGG代謝通路結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 人乳、牛乳、羊乳蛋白酶解后的鑒定結(jié)果分析

圖1 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白組成Fig.1 Composition of whey proteins in goat milk、bovine milk and human milk

由圖1所示，測得羊乳乳清蛋白中共含有156種蛋白，少于牛乳的278種蛋白及人乳的454種蛋白，其中牛乳與人乳乳清蛋白蛋白質(zhì)種類與楊梅等[22]的數(shù)據(jù)，人乳460種、牛乳284種較為接近。這主要是由兩方面原因造成的：一方面是由于人乳營養(yǎng)更為豐富，蛋白種類較牛乳、羊乳更多；另一方面是由于羊乳和牛乳，尤其是羊乳的數(shù)據(jù)庫不夠完善。從數(shù)據(jù)中可以看出，羊乳和牛乳乳清蛋白種類數(shù)量上有所欠缺，無法完全代替人乳在嬰幼兒生長發(fā)育階段的作用。

2.2 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白的組成分析

由圖2可知，羊乳中含有99種特異性表達蛋白質(zhì)，牛乳中有152種特異性表達蛋白質(zhì)，人乳中含有344種特異性表達蛋白質(zhì)。這說明羊乳與牛乳、人乳的乳清蛋白在蛋白質(zhì)組成上還存在較大差異。但有31種蛋白質(zhì)在羊乳與牛乳乳清蛋白中均有表達，15種蛋白質(zhì)在羊乳與人乳乳清蛋白中均有表達，說明羊乳能夠在部分種類的蛋白質(zhì)上代替牛乳及人乳。因此，對羊乳的蛋白質(zhì)組成分析，能夠為日后生產(chǎn)嬰幼兒食品及功能性食品提供新的來源，同時也能為羊乳的進一步研究和開發(fā)提供了一定的理論參考。

圖2 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白種類的維恩圖Fig.2 Venn diagram of whey protein species in goat milk,bovine milk and human milk

2.3 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白GO功能分析

2.3.1 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白參與的生物過程分析

圖3 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白參與的生物過程Fig.3 Biological process of whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

對三種乳的乳清蛋白蛋白進行數(shù)據(jù)庫檢索，選擇主要的生物過程（如圖3）。三種乳乳清蛋白的生物過程主要是免疫系統(tǒng)過程、定位作用、應(yīng)激反應(yīng)、多生物過程、生物粘附和生物調(diào)節(jié)等。通過對三種乳乳清蛋白參與生物過程的分析可知，三種乳乳清蛋白在生物調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮的作用最高，其次是對刺激的反應(yīng)，其中人乳在參與各項生物過程的乳清蛋白種類數(shù)明顯高于牛乳與羊乳，而羊乳與牛乳差異不明顯。生物調(diào)節(jié)包括，神經(jīng)調(diào)節(jié)、體液調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、分級調(diào)節(jié)等，是人體所需要的重要生物過程，對嬰幼兒的生長發(fā)育起到關(guān)鍵作用。應(yīng)激反應(yīng)也極其重要，嬰兒離開母體體內(nèi)環(huán)境，接觸外界不同的環(huán)境，這種環(huán)境轉(zhuǎn)變，需要嬰兒機體具有良好的應(yīng)激反應(yīng)能力，這樣才可以讓嬰兒盡早地適應(yīng)外界環(huán)境變化，維持機體健康生長。羊乳乳清蛋白在以上幾個生物過程中都有參與，且參與的蛋白質(zhì)種類數(shù)與牛乳相近，表明羊乳可以與牛乳作為嬰幼兒功能性食品來源，但不能完全替代人乳。

2.3.2 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白參與的分子功能分析

圖4 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白具有的分子功能Fig.4 Molecular function of whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

通過GO功能注釋中的分子功能分析（如圖4），可知三種乳乳清蛋白主要具有的分子功能為調(diào)節(jié)作用、結(jié)合作用、抗氧化活性和酶調(diào)節(jié)活性等。其中，羊乳乳清蛋白在抗氧化活性、酶調(diào)節(jié)活性以及調(diào)節(jié)作用上與人乳、牛乳的乳清蛋白相接近，但在結(jié)合作用上與人乳具有較大差異。通過數(shù)據(jù)庫分析可知，三種乳乳清蛋白的結(jié)合作用主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、抗原結(jié)合和離子結(jié)合等，這些都對嬰幼兒的成長發(fā)育起到重要作用。例如，蛋白質(zhì)的結(jié)合作用可以將其他物質(zhì)與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成結(jié)合蛋白，以此擴展蛋白質(zhì)功能；碳水化合物衍生物結(jié)合作用影響著嬰幼兒對碳水化合物及其衍生物的吸收和利用；抗原結(jié)合能夠起到激活補體，促進吞噬的作用等[23]。羊乳在以上幾個結(jié)合功能中都有良好表現(xiàn)，該數(shù)據(jù)也為羊乳的進一步開發(fā)和研究，提供了一定的理論參考依據(jù)。

2.3.3 人乳、牛乳、羊乳乳清蛋白的細胞組成分析

圖5 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白參與的細胞組成Fig.5 Composition of cells involved for whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

由圖5可知，三種乳乳清蛋白參與形成的細胞組成有胞外區(qū)、血的微粒、胞囊、細胞器以及內(nèi)膜系統(tǒng)等。其中主要是胞外區(qū)及細胞器區(qū)。胞外區(qū)是許多細胞表面功能分子的特異結(jié)構(gòu)區(qū)，在此區(qū)域發(fā)生很多細胞激活反應(yīng)，是分子發(fā)揮結(jié)合功能的重要區(qū)域。細胞器包含，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核糖體等細胞器，對嬰幼兒生長發(fā)育起重要作用[24]。羊乳乳清蛋白雖然較人乳乳清蛋白在參與細胞組成功能上有較大差距，但其能夠參與大多對人體有益的細胞組成功能，且不遜與牛乳乳清蛋白，因此羊乳乳清蛋白能夠一定程度上代替牛乳在嬰幼兒生長發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4 KEGG通路分析

圖6 羊乳乳清蛋白吞噬功能KEGG通路Fig.6 Phagocytosis KEGG pathway of whey protein in goat milk

如表1所示，羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白分別參與13種、12種以及24種KEGG通路，其中三種乳共有的通路有5種，人乳與牛乳共有的通路有3種，人乳與羊乳共有通路有3種。在5種三者共有的通路中，補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)以及吞噬作用，作為人體固有免疫系統(tǒng)反應(yīng)，對嬰幼兒具有重要作用。以吞噬作用為例，人體吞噬作用主要依靠吞噬細胞和中性粒細胞等的協(xié)同作用，以及起輔助作用的補體系統(tǒng)[25]。羊乳乳清蛋白中，蛋白質(zhì)名為補體C3（loc443475）、類補體 C3 (LOC101103133)以及類補體 C3(LOC101113831)等的蛋白，能夠?qū)ρa體受體CR3等造成積極影響（如圖6），從而間接促進嬰幼兒免疫能力的提高。另外，從表1中可以看出，羊乳乳清蛋白雖然和牛乳乳清蛋白一樣，與人乳乳清蛋白有多種共有通路，但還有許多人乳乳清蛋白特有的通路，如半乳糖代謝、丙酮酸代謝等是羊乳乳清蛋白無法代替的。綜上可知，羊乳可以作為嬰幼兒功能性食品的來源之一，但無法完全替代人乳。

表1 羊乳、牛乳、人乳中乳清蛋白參與KEGG通路種類數(shù)表Table 1 Number of KEGG pathway in whey protein in goat milk, bovine milk and human milk

3 結(jié)論

3.1 利用液質(zhì)聯(lián)用，從羊乳中鑒定出156種蛋白。從GO功能注釋分析中可以看出，羊乳乳清蛋白在生物過程中主要參與生物調(diào)節(jié)過程；在分子功能上主要發(fā)揮結(jié)合作用；在細胞組成上主要參與胞外區(qū)和細胞器區(qū)的組成。主要參與的KEGG通路為補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)以及吞噬作用，能夠?qū)γ庖呦到y(tǒng)的補體系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響。

3.2 通過對羊乳乳清蛋白的 GO功能注釋及 KEGG通路的分析可知，羊乳乳清蛋白在生物過程、分子功能、細胞組成上發(fā)揮重要的功能，可以一定程度上對嬰幼兒發(fā)揮生長發(fā)育起作用，能夠作為嬰幼兒食品的良好替代品。