蔡教英，姚麗鋒，王小玉，游淑珠，丁琦

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519015）

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積持續(xù)增加。全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積由170萬公頃（1996年）增加至20億公頃（2015年），且轉(zhuǎn)基因作物的種植面積前6位的國家一次是美國、巴西、阿根廷、印度和中國[1]。近年來，轉(zhuǎn)基因作物帶來的食品安全和環(huán)境安全問題一直是一個關(guān)注的熱點，目前公眾對轉(zhuǎn)基因作物到底含有哪些轉(zhuǎn)基因及其相應(yīng)含量尤為關(guān)注，因此許多國家和地區(qū)均出臺了轉(zhuǎn)基因限量規(guī)定，并實施了標(biāo)識管理措施。然而各個國家或地區(qū)做規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)識管理措施存在很大差異[2]，為了打破國際貿(mào)易壁壘和促進標(biāo)識管理制度的順利進行，迫切需要對作物中轉(zhuǎn)基因含量建立可靠、準(zhǔn)確的定量分析方法。

目前應(yīng)用最廣的定量檢測方法是實時熒光定量PCR技術(shù)，該方法需要通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來進行定量，但是在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程，容易受到樣品中抑制劑等的影響，導(dǎo)致準(zhǔn)確性降低[3]。數(shù)字 PCR（digital polymerase chain reaction PCR，dPCR），又成為“第三代 PCR”技術(shù)，是一種近年來發(fā)展迅速的檢測手段，在轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域擁有巨大的潛能。微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是將反應(yīng)體系分割成很多微小的反應(yīng)微滴，實現(xiàn)每個反應(yīng)微滴只有單個模板分子進行PCR擴增，根據(jù)泊松分布原理，按陽性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計算目標(biāo)分子拷貝數(shù)，實現(xiàn)絕對定量[4,5]。國內(nèi)外已有將微滴式數(shù)字 PCR平臺應(yīng)用于精準(zhǔn)定量轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的報道[6～10]。本研究以轉(zhuǎn)基因油菜RF1品系作為研究對象，建立其內(nèi)參基因及品系特異性基因的 ddPCR定量檢測方法。全球轉(zhuǎn)基因油菜的種植面積從2015年的850萬公頃增加到2016年的860萬公頃[11]。美國、加拿大和澳大利亞的轉(zhuǎn)基因菜籽油的邊際產(chǎn)量均有所增加，滿足了全球?qū)κ秤糜偷男枨蟆Ｖ抢灿蟹N植，但僅作為種子使用，不用來榨油。在短期內(nèi)，為了應(yīng)對菜籽油和生物柴油日漸增加的使用需求，全球油菜需求量可能會顯著增加。轉(zhuǎn)基因油菜籽是我國廣泛應(yīng)用的加工原料，根據(jù)我國的“轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例”，要求對轉(zhuǎn)基因油菜種子、油菜籽及其加工產(chǎn)品進行強制標(biāo)識管理[12]。為此，本研究擬建立一種轉(zhuǎn)基因油菜RF1雙重ddPCR定量方法，為實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜RF1精準(zhǔn)定量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

轉(zhuǎn)基因油菜RF1、RF2、MS1、MS2和T45品系以及轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于美國油脂化學(xué)家協(xié)會（American OilChemists' Society，AOCS）。非轉(zhuǎn)基因油菜、大豆樣品為本實驗室儲備。Premix Ex Taq TM，大連寶生物；MasterMix(2×)、ddPCR Droplet Generation Oil、GD8 Cartridge均購自美國伯樂公司；引物和探針由invitrion公司合成，稀釋為終濃度為10 μmol/L的工作液使用。ddPCR Super Mix、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8Cartridge、Droplet Generator DG8 Gasket、plate holder 美國 Bio-Rad 公司；QX200 Droplet Digital PCR系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 引物探針和特異性驗證

根據(jù)文獻選取磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenilpyruvate-carboxylsae，PEP)和油菜RF1特異性基因序列，選取適用于數(shù)字PCR的引物探針對，序列信息（見表1），并在實時熒光PCR儀上驗證特異性，擴增體系為：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各 1 μL，探針(10 μmol/L)各 0.25 μL，DNA 模板 2 μL，補水至 25 μL。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性 95 ℃、5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，收集熒光信號45個循環(huán)。

表1 引物探針序列表Table 1 Primer probe sequence for ddPCR

1.2.2 擴增穩(wěn)定性試驗

為驗證轉(zhuǎn)基因油菜RF1品系標(biāo)準(zhǔn)品在微滴式數(shù)字PCR的擴增穩(wěn)定性，以30 ng/μL轉(zhuǎn)基因油菜RF1品系基因組DNA按照下述反應(yīng)體系和參數(shù)進行檢測，同時設(shè)置3個平行進行檢測，3個平行的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不超過25%。

數(shù)字PCR 反應(yīng)體系：2×MasterMix 10 μL，引物(10 μmol/L)各 1 μL，探針(10 μmol/L)各 0.25 μL，DNA 模板2 μL，補水至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃、5 min (1 ℃/s)；94 ℃ 15 s，60 ℃、1 min (1 ℃/s)，共 45 個循環(huán)；98 ℃、10 min(1 ℃/s)，12 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后將96孔反應(yīng)板置微滴分析儀中讀取數(shù)據(jù)，應(yīng)用 QuantaSoft V1.3.2軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 線性范圍驗證

將油菜 RF1品系標(biāo)準(zhǔn)品的基因組稀釋至 30 ng/μL，用 0.1×TE (Tris-HCl，EDTA-Na，pH 8.0)緩沖液進行6個梯度的梯度稀釋，將原始基因組分別稀釋至 6，1.2，0.24，0.12，0.024，0.0048 ng/μL，將以上梯度稀釋組的DNA模板進行數(shù)字PCR檢測，每個濃度梯度組包含3個平行，平行間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不超過25%。檢測結(jié)果RSD（＜25%）的樣品拷貝數(shù)為定量檢測限（LOQ），能夠檢測的樣品最低拷貝數(shù)為檢測限（LOD）。

1.2.4 定量檢測限和檢測限的驗證

取上一步線性范圍下限的DNA樣品進行LOQ的驗證。將該DNA進行十個平行的數(shù)字PCR驗證，計算每個平行的單位體積的內(nèi)參基因和外源基因的拷貝數(shù)，計算平均值和RSD值，RSD要求小于25%。

1.2.5 精密度試驗

選取外源基因LOQ臨界值和LOQ臨界值10倍濃度的DNA樣品進行精密度驗證，每個樣品做5個平行。通過數(shù)字PCR對其拷貝數(shù)進行測定，計算其定量檢測的精密度，檢測結(jié)果要求RSD小于25%。

1.2.6 準(zhǔn)確度試驗

取LOQ值，LOQ5倍，LOQ值25倍的3組陽性進行準(zhǔn)確度的驗證。對以上3組DNA樣品進行三個平行的數(shù)字PCR實驗。通過測定拷貝數(shù)計算其定量檢測的準(zhǔn)確度，檢測結(jié)果要求RSD小于25%。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物探針特異性驗證

圖1 PEP和RF1特異性熒光PCR結(jié)果Fig.1 Specificity of RF1 by real-time PCR

應(yīng)用熒光 PCR方法對轉(zhuǎn)基因油菜 RF1品系、5種轉(zhuǎn)基因油菜、1種大豆基因組DNA和1種非轉(zhuǎn)基因大豆、1種非轉(zhuǎn)基因油菜進行擴增的結(jié)果如圖1所示。6個油菜基因組DNA在HEX通道下都有擴增曲線，而大豆基因組DNA未見擴增曲線（見圖1a）。在FAM通道下，只有轉(zhuǎn)基因油菜RF1品系有擴增曲線，其余的DNA均未見擴增曲線，結(jié)果表明該引物探針對特異性好（見圖1b）。

2.2 擴增穩(wěn)定性驗證結(jié)果

采用1.2.2中數(shù)字PCR反應(yīng)體系和參數(shù)，對油菜RF1標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)源基因PEP和RF1品系特異性序列進行穩(wěn)定性驗證的數(shù)據(jù)見表2，熱點圖如圖2所示，圖2a為PEP內(nèi)參基因，圖2b為外源基因。在此反應(yīng)體系中，模板的添加量為30 ng，按照單倍體油菜基因組1.3 pg計算，預(yù)期體系中內(nèi)參基因的拷貝數(shù)為23077個。從圖2可以看出數(shù)字PCR所獲得的陰性點與陽性點之間有明顯的熒光信號差距，可以通過設(shè)置統(tǒng)一的閾值限進行陰性反應(yīng)點和陽性反應(yīng)點的區(qū)分。內(nèi)參基因三次擴增重復(fù)的實際檢測拷貝數(shù)分別為 24520、24480和24240，平均檢測拷貝數(shù)為24413，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%；外源基因三次擴增重復(fù)的實際檢測拷貝數(shù)分別為25000、24880和24800，平均檢測拷貝數(shù)為24893，RSD為0.40%。本文所用的內(nèi)參基因和外源基因的引物探針擴增穩(wěn)定性良好，并且該陽性樣品穩(wěn)定可用。

表2 油菜RF1擴增穩(wěn)定性驗證Table 2 Stability of RF1

2.3 線性范圍驗證結(jié)果

圖3 RF1數(shù)字PCR線性范圍擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of the RF1 ddPCR assay

線性范圍驗證實驗檢測結(jié)果見表 3，線性范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 3。由實際拷貝數(shù)的檢測結(jié)果和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，本標(biāo)準(zhǔn)方法在單位體系內(nèi)參基因拷貝數(shù)位于 18～23077的區(qū)間內(nèi)可以呈現(xiàn)出良好的線性，r2為0.999，所有濃度組的RSD值位于1.23%到11.45%之間，均小于25%；外源基因拷貝數(shù)位于 18～23077的區(qū)間內(nèi)可以呈現(xiàn)出良好的線性，r2為0.999，所有濃度組的RSD值位于1.01%到21.43%之間，均小于25%。因此，本方法在內(nèi)參基因和外源基因拷貝數(shù)位于18～23077時，具有良好的定量能力。

表3 RF1數(shù)字PCR的線性范圍驗證Table 3 Dynamic range of RF1 for ddPCR

2.4 定量檢測限和檢測限的驗證結(jié)果

定量檢測限和檢測線實驗結(jié)果見表4。LOQ試驗中內(nèi)源基因和品系特異性基因的RSD分別為17.87%和15.58%，均小于25%。這說明方法可以對單位體積內(nèi)源基因和外源基因拷貝數(shù)為 18的樣品進行穩(wěn)定的定量檢測。LOD驗證結(jié)果如表5所示。十個平行試驗中，陽性檢出率為10個，符合LOD質(zhì)控的要求（不低于9個）。因此本方法可以對單位體積外源基因拷貝數(shù)為3.7的樣品進行穩(wěn)定檢測。

表4 RF1數(shù)字PCR的LOQ驗證Table 4 Verification of the LOQ of RF1 by ddPCR

表5 RF1數(shù)字PCR的LOD驗證Table 5 LOD verification of the RF1 by ddPCR

2.5 精密度試驗結(jié)果

精密度試驗檢測結(jié)果見表6。綜合分析LOQ臨界點和臨界點10倍的DNA樣品的檢測結(jié)果，兩組濃度的DNA樣品所得到的組內(nèi)RSD值分別為24.50%、17.39%和10.60%、8.40%，符合整個方法對于精密度的要求（RSD小于25%）。

2.6 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

取LOQ值，LOQ5倍，LOQ值25倍進行數(shù)字PCR實驗。實驗結(jié)果如表7所示，對于濃度為0.024，0.12，0.6 ng/μL的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，所測得拷貝數(shù)百分比的平均值分別為112.6%，106.0%和107.2%，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品理論拷貝數(shù)百分比為 100%，計算得到濃度為0.024，0.12，0.6 ng/μL的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測偏差分別為12.64%，5.97%和7.20%，三組偏差均符合要求（小于 25%）。因此本方法可以比較準(zhǔn)確的對油菜RF1品系進行絕對定量檢測。

表6 RF1數(shù)字PCR的精密度驗證Table 6 Precision of the RF1 by ddPCR

表7 RF1數(shù)字PCR的準(zhǔn)確度驗證Table 7 Accuracy of the RF1 by ddPCR

3 結(jié)論

3.1 目前，國際上最常用的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因檢測的方法主要基于核酸的PCR反應(yīng)。前人根據(jù)油菜中所轉(zhuǎn)入的外源性基因種類制備基因芯片，其檢測的特異性和重復(fù)性較好，但是在檢測低含量的轉(zhuǎn)基因油菜時的靈敏度為0.5%[14]。還有研究者利用熱不對稱交錯PCR檢測轉(zhuǎn)基因油菜Oxy-235，其絕對LOD和LOQ分別為10個拷貝數(shù)和20個拷貝數(shù)[13]。2003年，我國國家質(zhì)檢總局頒布了轉(zhuǎn)基因油菜篩選、基因檢測普通PCR和實時熒光 PCR方法[15,16]。李想等人利用實時熒光PCR對我國進口油菜籽進行了轉(zhuǎn)基因品系分布及轉(zhuǎn)基因成分含量情況進行了詳細的分析，研究結(jié)果表明，含MS1×RF1和MS1×RF2的檢出率約為40%[10]。但是，普通PCR和實時熒光PCR反應(yīng)易受引物之間的相互干擾和DNA樣品的純度等因素的影響，從而影響PCR擴增效率。數(shù)字PCR是一種新的核酸檢測和定量分析方法，具有特異性好、靈敏度高，其檢測結(jié)果直接反應(yīng)樣品的拷貝數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線和參考樣品無關(guān)。國內(nèi)還為見采用雙重ddPCR對轉(zhuǎn)基因油菜籽產(chǎn)品進行定量分析的報道。

3.2 本文在國內(nèi)首次建立了轉(zhuǎn)基因油菜籽 RF1雙重ddPCR定量分析方法。通過對引物探針的特異性進行篩查，同時還驗證了擴增穩(wěn)定性、線性范圍、確定了定量檢測限和檢測限，也對精密度、準(zhǔn)確度進行了研究。結(jié)果顯示本研究所建立的轉(zhuǎn)基因油菜籽RF1雙重數(shù)字ddPCR定量方法特異性好、擴增穩(wěn)定性好。綜上所述，本研究建立的轉(zhuǎn)基因油菜籽 RF1雙重 ddPCR定量分析方法可用于轉(zhuǎn)基因油菜RF1的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測。