王青 張亞楠 張偉云 吳春 黃秀梅 畢麗偉 王雅英

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1；R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0774-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.13

摘 要 目的：建立烏拉爾甘草的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜。方法：采用UPLC法。色譜柱為Waters CORTECS UPLC C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。以甘草酸為參照，測(cè)定27批藥材樣品的UPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰，并對(duì)27批藥材樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果：27批藥材樣品的UPLC圖譜有20個(gè)共有峰；除S2、S4、S19、S21、S22、S24藥材樣品的相似度小于0.90外，其余21批藥材樣品相似度均大于0.90；經(jīng)驗(yàn)證，該21批藥材樣品UPLC圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性。27批藥材樣品可聚為3類(lèi)，S24為Ⅰ類(lèi)，S2、S4、S12、S19、S21、S22為Ⅱ類(lèi)，其余為Ⅲ類(lèi)。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為甘草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 烏拉爾甘草；超高效液相色譜；指紋圖譜；聚類(lèi)分析；質(zhì)量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of Glycyrrhiza uralensis. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters CORTECS UPLC C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 1 μL. Using glycyrrhizic acid as control， UPLC chromatograms of 27 batches of sample were determined. Similarity evaluation was conducted by using TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A edition） to determine common peak and conduct cluster analysis of 27 batches of samples. RESULTS： There were 20 common peaks in UPLC chromatograms of 27 batches of samples. The similarity degree of S2，S4，S19，S21，S22，S24 were less than 0.90，the others samples were more than 0.90. After validation， UPLC chromatograms of 21 batches of batches of samples were in good agreement with control fingerprint. 27 batches of samples were clustered into 3 categories， in which S24 was categoryⅠ； S2，S4， S12， S19， S21， S22 were categoryⅡ； other were categoryⅢ. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of G. uralensis.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis； UPLC； Fingerprint； Cluster analysis； Quality control

甘草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定甘草為豆科植物甘草（又稱(chēng)烏拉爾甘草，Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（G. inflata Bat.）或光果甘草（G. glabra L.） 的干燥根和根莖[1]，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效。甘草是最常用的中藥之一，據(jù)報(bào)道60%的中藥復(fù)方中含有甘草，有關(guān)甘草藥材的化學(xué)成分研究前期已較深入，近幾年又從其中分離得到了新的化學(xué)成分[2-4]。雖然2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定甘草的藥材來(lái)源有3種，但據(jù)筆者調(diào)研所知，目前市場(chǎng)上流通的藥材品種主要是烏拉爾甘草（也是栽培面積最大的一個(gè)品種），其他兩種藥材在流通市場(chǎng)已很難見(jiàn)到。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下關(guān)于甘草藥材的質(zhì)量控制是對(duì)主要成分甘草酸和甘草苷進(jìn)行薄層色譜鑒別（TLC）及高效液相色譜法（HPLC）含量測(cè)定，也有針對(duì)甘草藥材及復(fù)方制劑的一些成分分析的相關(guān)報(bào)道，但這種僅測(cè)定一兩個(gè)指標(biāo)成分的含量難以滿(mǎn)足對(duì)藥材質(zhì)量的全面控制[5-7]。為此，筆者收集了不同地區(qū)產(chǎn)地的烏拉爾甘草，建立其超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析等方法，對(duì)烏拉爾甘草進(jìn)行質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)，以期全面地控制該藥材質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class型UPLC儀，包括四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣品管理器、二極管陣列檢測(cè)器和Empower 2色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AG285型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司） ；ZEALWAY S10H型超聲提取器[致微（廈門(mén)）儀器有限公司]；XFB-200型萬(wàn)能粉碎機(jī)（湖南中誠(chéng)制藥機(jī)械廠）。

1.2 試劑

甘草酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15080510）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15082811）、異甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15031204）、甘草素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15021104）、異甘草素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15042010）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，經(jīng)氫譜、碳譜、質(zhì)譜、紅外光譜和紫外光譜等檢測(cè)確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，按HPLC歸一化法測(cè)得其純度均大于98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

烏拉爾甘草（S1～S27）于2016年2月購(gòu)于全國(guó)不同省份（見(jiàn)表1），經(jīng)廈門(mén)醫(yī)學(xué)院王雅英教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18（100 mm ×2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A） -0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2）；流速：0.30 mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：1 μL[8-9]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各待測(cè)成分對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解并定容，得單一對(duì)照品貯備液。分別取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取藥材樣品粉末（過(guò)40目篩）1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加70%甲醇溶液40 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）提取30 min，放冷；再次稱(chēng)定質(zhì)量，加70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以甘草酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.07%～0. 22%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.32%～1.25%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以甘草酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.28%～0.74%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.03%～2.52%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材樣品（編號(hào)：S1）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以甘草酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，20個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.18%～0.69%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.71%～1.30%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 UPLC指紋圖譜的生成 取27批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)27批藥材樣品的UPLC圖譜進(jìn)行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），以藥材樣品共有模式為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，除S2、S4、S19、S21、S22及S24 等6批藥材樣品的相似度較低（<0.90）外，其余21批藥材樣品的相似度均大于0.90，且與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性，表明大部分藥材樣品間差異較小、質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表3、表4。

2.4.3 UPLC指紋圖譜中共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A 版）對(duì)27批藥材樣品的UPLC圖譜進(jìn)行比較分析[10]。27批藥材樣品有20個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照，指認(rèn)了其中的5個(gè)峰，分別為2號(hào)峰（甘草苷）、5號(hào)峰（異甘草苷）、6號(hào)峰（甘草素）、8號(hào)峰（異甘草素）、12號(hào)峰（甘草酸）。其中，12號(hào)色譜峰分離良好、峰面積最大且為所有藥材樣品共有，確定其為參照峰，計(jì)算其他峰相對(duì)于12號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，詳見(jiàn)表5～表8。

2.5 聚類(lèi)分析

運(yùn)用SPSS 19. 0軟件對(duì)甘草指紋圖譜中共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，采用組間平均數(shù)聯(lián)接法，根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，將藥材樣品大致分為3大類(lèi)：S24為Ⅰ類(lèi)，S2、S4、S12、S19、S21、S22為Ⅱ類(lèi)，其余為Ⅲ類(lèi)，詳見(jiàn)圖3。

3 討論

甘草中含有大量的以甘草苷、甘草素為代表的黃酮苷元及其苷類(lèi)，甘草酸、甘草次酸為代表的三萜皂苷類(lèi)以及香豆素、二苯乙烯類(lèi)等數(shù)量眾多的化合物。甘草不僅以單方及復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床，還被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品工業(yè)。本研究建立的UPLC法較HPLC法分析時(shí)間更短、色譜峰分離度更好，并確認(rèn)了指紋圖譜中含量較高的主要色譜峰。通過(guò)相似度評(píng)價(jià)和聚類(lèi)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27批不同產(chǎn)地藥材樣品中，21批藥材的指紋圖譜相似度均大于0.90，說(shuō)明該藥材質(zhì)量總體較為穩(wěn)定； 對(duì)于試驗(yàn)得到的20個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品比較，明確了5個(gè)主要成分的歸屬。另外，對(duì)于藥材樣品中大量的其他未知成分，尚需進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜、藥效學(xué)研究等手段進(jìn)行深入探討，以說(shuō)明其差異對(duì)質(zhì)量?jī)?yōu)劣的影響。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于建立科學(xué)、合理的甘草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)均有重要的意義。

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（收稿日期：2017-06-16 修回日期：2017-08-15）

（編輯：張 靜）