張宇瓊 高晶晶 陸文香 張宇藺 袁壚 徐衛(wèi)東

中圖分類號(hào) R446.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0794-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.17

摘 要 目的：為臨床合理用藥與醫(yī)院感染控制提供參考。方法：收集我院2014年1月-2017年6月檢出的鮑曼不動(dòng)桿菌（AB），采用紙片擴(kuò)散法和最低抑菌濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。采用聚合酶鏈反應(yīng)法對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDR-AB）耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果：共檢出AB 1 758株，主要來自于痰液及咽拭子標(biāo)本（65.24%），其次為尿液標(biāo)本（18.49%）；主要分布于重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）（38.51%）和呼吸內(nèi)科（24.00%）。AB對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、慶大霉素、頭孢吡肟、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、亞胺培南等大部分常用抗菌藥物的耐藥率均超過了40%，且有逐年上升的趨勢(shì)；對(duì)黏菌素的耐藥率<5%，且逐年下降。共檢出MDR-AB 673株，各年度檢出率依次為22.77%、29.82%、52.09%、54.33%。110株檢測(cè)耐藥基因的MDR-AB菌株中，TEM、AmpC、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24、OXA-51、aac（6′ ）-Ⅰ、aac（3）-Ⅰ、ant（3″ ）-Ⅰ、anmA、gyrA、parC基因的檢出率分別為97.27%、91.82%、49.09%、12.73%、90.91%、12.73%、98.18%、34.55%、60.91%、89.09%、87.27%、77.27%、82.73%。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，gyrA基因第83、121位堿基發(fā)生點(diǎn)突變，parC基因第144位堿基發(fā)生點(diǎn)突變。結(jié)論：我院AB主要來自于痰液及咽拭子標(biāo)本，主要集中在ICU和呼吸內(nèi)科；耐藥情況嚴(yán)重，MDR-AB的檢出率逐年升高。多重耐藥菌株檢出的主要基因包括TEM、AmpC、OXA-23、OXA-51、ant（3″ ）-Ⅰ、anmA等，且gyrA、parC基因存在突變。臨床應(yīng)加大抗菌藥物分級(jí)使用管理力度，加強(qiáng)AB耐藥性監(jiān)測(cè)，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選擇抗菌藥物，防止或延緩AB耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)定植與交叉?zhèn)鞑ァ?/p>

關(guān)鍵詞 鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；耐藥性；臨床分布；耐藥基因

ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for rational drug use in clinic and nosocomial infection control. METHODS： Acinetobacter baumannii（AB） were collected from our hospital during Jan. 2014-Jun. 2017. Drug sensitivity tests were conducted by using K-B method and MIC method. Drug-resistance genes of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii（MDR-AB）were amplified by PCR， and compared with GenBank database by using Blast comparison. RESULTS： A total of 1 758 strains of AB were detected， and mainly came from sputum and throat swab （65.24%）， followed by urine （18.49%）. These infected patients were mainly distributed in the departments of ICU （38.51%） and respiratory medicine （24.00%）， respectively. Drug resistance of clinical isolated AB to most commonly used antibiotics were more than 40%， such as compound sulfamethoxazole， piperacillin sodium and tazobactam sodium， gentamicin， cefepime， levofloxacin， minocycline， imipenem， etc.； it had increased year after year. Drug resistance to colistin was lower than 5% and decreased year by year. A total of 673 strains of MDR-AB were detected， and detection rates were 22.77%，29.82%，52.09%，54.33%， respectively. Among 110 strains of MDR-AB， detection rates of TEM， AmpC， IMP， VIM， OXA-23， OXA-24， OXA-51， aac（6′ ）-Ⅰ， aac（3）-Ⅰ， ant（3″ ）-Ⅰ， anmA， gyrA， parC gene were 97.27%， 91.82%， 49.09%， 12.73%、90.91%， 12.73%， 98.18%， 34.55%， 60.91%， 89.09%， 87.27%， 77.27%， 82.73%， respectively. Results of Blast comparison showed that point mutation occurred in 83rd and 121st base of gyrA gene， 144th base of parC gene. CONCLUSIONS： AB mainly come from sputum and throat swab specimens in our hospital， and infected patients are mainly distributed in the departments of ICU and respiratory medicine. Drug resistance is serious， and the detection rate of MDR-AB is increased year by year. Main genes of multidrug-resistant strains mainly include TEM， AmpC， OXA-23， OXA-51， ant（3″ ）-Ⅰ， anmA， etc.， and mutation of gyrA and parC gene are found. It is necessary to strengthen the management of classification use of antibiotics and strengthen the monitoring of AB drug resistance. According to the results of drug sensitivity test， antibiotics are selected rationally to prevent or delay planting and cross transmission of AB-resistant strain.

KEYWORDS Acinetobacter baumannii； Multidrug-resistance； Drug resistance； Clinical distribution； Drug-resistance gene

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii， AB）生存條件簡(jiǎn)單，且廣泛存在于自然環(huán)境中，并可長(zhǎng)期定植于人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位，是醫(yī)院最常見的條件致病菌之一，可引起呼吸道感染、傷口及術(shù)后感染、繼發(fā)性腦膜炎、敗血癥和尿路感染等[1-2]。住院患者由于免疫力下降、大量應(yīng)用抗菌藥物而導(dǎo)致菌群失調(diào)，已成為AB的易感人群，尤其是多重耐藥AB（Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii，MDR-AB）；同時(shí)，MDR-AB已成為醫(yī)院內(nèi)感染爆發(fā)流行的重要病原菌，給臨床治療帶來很大困難[3-4]。筆者通過收集我院2014-2017年臨床分離的AB的病原學(xué)資料，回顧性分析其科室分布、耐藥性及耐藥基因，以期為臨床合理用藥、醫(yī)院感染控制提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集我院2014年1月-2017年6月臨床各科室送檢標(biāo)本中分離的AB（剔除同一患者檢出的重復(fù)菌株）的病原學(xué)資料。

1.2 材料

PhoneixTM 100型全自動(dòng)微生物分析儀（美國(guó)BD公司）；Microflex LT型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（德國(guó)Bruker公司）；5804R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；瓊脂糖（美國(guó)Sigma公司）；Syngene 1467型紫外凝膠電泳成像儀、T100 Thermal Cycle型擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和M-H瓊脂平板均購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；聚合酶鏈反應(yīng)（Polymersase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑（dNTP mixture、10×Ex Taq buffer、Ex Taq酶、6×Loading buffer、DNA Ladder marker）和電泳試劑均購(gòu)自大連TaKaRa公司；質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）由北京中原公司提供。

1.3 菌株分離、培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)

菌株的分離、培養(yǎng)參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）[5]進(jìn)行。所有菌株均首先采用Microflex LT型MALDI-TOF MS儀進(jìn)行快速鑒定，然后采用PhoneixTM 100型全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定與藥敏試驗(yàn)。其中，米諾環(huán)素和頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散（Kirby-Bauer，K-B）法，其余均采用最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）法。藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行處理，結(jié)果判定參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）各年的標(biāo)準(zhǔn)。MDR-AB是指對(duì)5類抗菌藥物（包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類、碳青霉烯類和喹諾酮類抗菌藥物）中的3類及以上耐藥的菌株[3-4]。

1.4 耐藥基因檢測(cè)

本研究采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法從2016年分離的MDR-AB中抽取了110株菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。采用加熱裂解法提取MDR-AB的DNA：挑取約5個(gè)菌落，加入雙蒸水500 μL，混勻，于100 ℃水浴中靜置20 min，以20 913×g離心2 min，取上清液，即得模板DNA，置于-20 ℃保存，備用。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）提供的耐藥基因，采用Oligo 7軟件（美國(guó)Molecular Biology Insights公司）設(shè)計(jì)引物，部分引物參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]。引物（序列見表1）由金斯瑞生物科技有限公司合成。采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）嚴(yán)格按照PCR相關(guān)試劑說明書配制。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，在各基因類型對(duì)應(yīng)的退火溫度下退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠電泳成像儀上觀察，檢測(cè)菌株相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.5 基因測(cè)序及比對(duì)

鑒于AB對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制[8]，本研究采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取部分敏感菌株和耐藥菌株的gyrA和parC基因擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Chromas 2.4分析軟件（澳大利亞Technelysium公司）讀取測(cè)序結(jié)果，并采用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）在線分析工具Blast程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)，以確定耐藥基因的突變情況。

2 結(jié)果

2.1 AB的標(biāo)本來源

2014-2017年，我院共分離AB 1 758株。所有菌株經(jīng)Microflex LT型MALDI-TOF MS儀及PhoneixTM 100型全自動(dòng)微生物分析儀鑒定為AB。AB主要來自于痰液及咽拭子標(biāo)本（65.24%），其次為尿液標(biāo)本（18.49%），詳見表2。

AB主要來源于重癥醫(yī)學(xué)科（Intensive care unit，ICU）和呼吸內(nèi)科，分別占38.51%和24.00%，詳見表3。

2.2 AB的耐藥情況

與2014年相比，2015年我院AB對(duì)阿米卡星和氨芐西林鈉舒巴坦鈉的耐藥率有所降低，而2016、2017年又迅速上升。AB對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、慶大霉素、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、亞胺培南、美羅培南等抗菌藥物的耐藥率均超過了40%，且有逐年上升的趨勢(shì)。其中，AB對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率已高達(dá)77.5%和78.3%。AB對(duì)黏菌素的耐藥率最低（耐藥率<5%），且逐年下降，詳見表4。

2.3 MDR-AB的檢出情況

2014-2017年，我院共檢出MDR-AB 673株，其每年的檢出率依次為22.77%、29.82%、52.09%、54.33%，呈逐年上升的趨勢(shì)，詳見表5。

2.4 MDR-AB耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

110株MDR-AB中，有107株檢出絲氨酸蛋白酶基因TEM，101株檢出頭孢菌素酶基因AmpC。金屬β-內(nèi)酰胺類相關(guān)耐藥基因中，IMP和VIM基因的檢出率分別為49.09%和12.73%。苯唑西林酶基因（OXA群）OXA-23、OXA-24、OXA-51的檢出率分別為90.91%、12.73%、98.18%。氨基糖苷類修飾酶基因aac（6′ ）-Ⅰ、aac（3）-Ⅰ、ant（3″ ）-Ⅰ、armA的檢出率分別為34.55%、60.91%、89.09%、87.27%。喹諾酮類相關(guān)耐藥基因gyrA、parC的檢出率分別為77.27%、82.73%，詳見表6。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，gyrA、parC均存在基因突變，其中g(shù)yrA可見第83位（TCA→TTA）和121位（TGT→CGT）堿基發(fā)生點(diǎn)突變，parC可見第144位（AGC→AAC）堿基發(fā)生點(diǎn)突變。

3 討論

AB具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力并在自然界中廣泛存在，長(zhǎng)期住院、免疫力低下以及行氣管插管或機(jī)械通氣的患者更容易被AB感染[9]。我院2014-2017年分離出的革蘭氏陰性桿菌中，AB的檢出量?jī)H次于大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，位居第3位，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)結(jié)果[4，10-11]基本一致，提示AB的流行具有一定的共性。我院AB主要來源于痰液及咽拭子標(biāo)本（包括上呼吸道標(biāo)本），其次為尿液和創(chuàng)口分泌物標(biāo)本，而血液和其他無菌體液標(biāo)本所占比例較小，提示AB主要引發(fā)上呼吸道感染。但值得注意的是，本研究尚無法排除上呼吸道定植菌群的影響，特別是部分沒有肺部感染癥狀卻檢出AB的患者。因此，臨床應(yīng)樹立和強(qiáng)化痰液標(biāo)本質(zhì)量控制的意識(shí)，送檢標(biāo)本必須來自于實(shí)際感染部位，必要時(shí)可采集支氣管肺泡灌洗液，提高送檢標(biāo)本的合格率；此外，由于痰液標(biāo)本較易獲得，在臨床送檢標(biāo)本中所占的比例略高，故為保證微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性并正確指導(dǎo)臨床用藥，應(yīng)提高血液及其他無菌體液標(biāo)本的送檢比例[12]。

ICU和呼吸內(nèi)科是AB檢出率較高的科室，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[13-14]相似。這2個(gè)排名靠前的科室具有以下共同點(diǎn)：患者多有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，且長(zhǎng)期臥床，并伴有免疫力低下、住院時(shí)間長(zhǎng)、廣泛應(yīng)用抗菌藥物、治療過程中常需接受氣管插管、反復(fù)吸氧以及留置導(dǎo)管等高危因素，容易受AB感染并引發(fā)交叉感染[3]。已有報(bào)道表明，需要持續(xù)機(jī)械通氣或燒傷/創(chuàng)傷患者分離培養(yǎng)出AB的概率更高[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，2014-2017年我院AB對(duì)大部分常用抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升的趨勢(shì)，對(duì)頭孢菌素類抗菌藥物（頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟）的耐藥率均超過了50%。耐藥率明顯升高的抗菌藥物包括復(fù)方磺胺甲噁唑、阿米卡星、米諾環(huán)素，其耐藥率分別從2014年的41.3%、40.5%、41.8%上升至2017年的76.6%、73.0%、74.1%。因β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦對(duì)不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌具有直接殺滅作用，故含舒巴坦的復(fù)合制劑對(duì)不動(dòng)桿菌具有良好的抗菌活性，可作為聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)[15]。本研究結(jié)果顯示，AB對(duì)于限制使用級(jí)抗菌藥物如哌拉西林鈉他唑巴坦鈉、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉等的耐藥率也有逐年上升的趨勢(shì)；此外，盡管2014-2015年AB對(duì)特殊使用級(jí)抗菌藥如亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為48.6%～57.7%、50.0%～59.2%，低于同期中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CHINET）所報(bào)道的62.0%～62.4%、66.7%～70.5%[16-17]，但2016年其耐藥率均明顯上升（69.7%和70.6%），臨床應(yīng)予以高度重視。

本研究結(jié)果顯示，2014-2017年我院MDR-AB的檢出率從22.77%上升至54.33%，筆者認(rèn)為很可能與碳青霉烯類抗菌藥物在我院臨床使用率較高有關(guān)；另一方面，AB對(duì)黏菌素的耐藥率從2.8%降至0，可能與臨床用藥過程中發(fā)現(xiàn)該藥常致腎臟和神經(jīng)損害而致臨床使用明顯減少有關(guān)[18]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，AB一旦對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，則多呈多重耐藥或泛耐藥，可供選擇的抗菌藥物也極為有限[19]。因此，臨床應(yīng)正確區(qū)分感染與定植，同時(shí)加大抗菌藥物合理應(yīng)用的管理力度；對(duì)于嚴(yán)重感染者，建議根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果謹(jǐn)慎合理用藥，并及時(shí)調(diào)整用藥劑量，以避免或延緩多重耐藥或泛耐藥菌株的出現(xiàn)。

隨著廣譜抗菌藥物的大量使用，加之AB耐藥基因易水平傳播，從而導(dǎo)致了MDR-AB的出現(xiàn)[20]。AB的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括多種藥物主動(dòng)外排泵參與介導(dǎo)了β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類及四環(huán)素類等多種藥物的耐藥，耐藥基因參與，生成藥物滅活酶，抗菌藥物作用靶點(diǎn)和外膜通透屏障的改變等[3，21-22]。本課題組前期研究顯示，MDR-AB菌株中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（如TEM、AmpC、OXA23等）以及對(duì)四環(huán)素和復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥的相關(guān)基因（如tetA、tetB、mdfA等）均呈高表達(dá)，一定程度上反映了AB耐藥機(jī)制的復(fù)雜性[23]。本研究從2016年臨床分離的MDR-AB中隨機(jī)抽取110株菌株（樣本量超過當(dāng)年MDR-AB檢出總量的1/3），對(duì)其耐藥基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是AB對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因。其中，110株MDR-AB中A類絲氨酸蛋白酶基因TEM的檢出率為97.27%；B類金屬β-內(nèi)酰胺酶基因IMP、VIM的檢出率相對(duì)較低，分別為49.09%和12.73%；C類頭孢菌素酶基因AmpC的檢出率為91.82%；D類苯唑西林酶基因OXA-23、OXA-24、OXA-51檢出率分別為90.91%、12.73%、98.18%。這提示AB主要產(chǎn)生A類酶和C類酶，這可能也是導(dǎo)致AB對(duì)頭孢吡肟、頭孢噻肟等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率較高的主要原因；同時(shí)，D類酶基因OXA-23、OXA-51的檢出率也較高，這可能是介導(dǎo)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要因素[23]；此外，氨基糖苷類耐藥基因ant（3″ ）-Ⅰ、armA亦有較高的檢出率，可見MDR-AB對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥可能與氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶有關(guān)[24]。有研究表明，AB菌株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥主要是由gyrA和parC基因突變所致[8]，故本研究對(duì)gyrA和parC基因進(jìn)行了序列測(cè)定與比對(duì)。結(jié)果顯示，喹諾酮類相關(guān)耐藥基因gyrA、parC的檢出率分別為77.27%和82.73%，且均存在突變位點(diǎn)，提示蘇州地區(qū)（我院同時(shí)也是蘇州市臨床檢驗(yàn)中心、蘇州市社區(qū)衛(wèi)生臨床集中檢測(cè)中心，檢測(cè)數(shù)據(jù)基本能反映蘇州地區(qū)的病原學(xué)特征）AB對(duì)喹諾酮類藥物耐藥與gyrA、parC基因突變有關(guān)。

綜上所述，我院AB主要來自于痰液及咽拭子、尿液標(biāo)本，主要分布于ICU和呼吸內(nèi)科，且耐藥情況嚴(yán)重，但對(duì)黏菌素敏感。MDR-AB的檢出率逐年升高，檢出的主要基因包括TEM、AmpC、OXA-23、OXA-51、ant（3″ ）-Ⅰ、armA、gyrA、parC等，且gyrA、parC存在基因突變。醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物分級(jí)使用管理的力度，減緩耐藥菌株產(chǎn)生；臨床應(yīng)合理使用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑，慎用碳青霉烯類抗菌藥物，聯(lián)合使用新型抗菌藥物如替加環(huán)素等[16]；此外，臨床還應(yīng)嚴(yán)格落實(shí)手衛(wèi)生規(guī)范，加強(qiáng)環(huán)境清潔與消毒，嚴(yán)格執(zhí)行隔離防護(hù)措施，并進(jìn)行細(xì)菌耐藥性篩查，從而阻止或延緩AB耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)定植和交叉?zhèn)鞑?。本研究雖初步反映了AB耐藥機(jī)制的多樣性，但其菌株耐藥基因的來源還有待于進(jìn)一步探討，同時(shí)也仍需對(duì)MDR-AB進(jìn)行更全面的基因檢測(cè)，從耐藥性與基因表達(dá)程度、酶產(chǎn)量、穩(wěn)定性等方面入手，深入探討耐藥表型與基因型之間的相關(guān)性。

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（收稿日期：2017-07-02 修回日期：2018-01-16）

（編輯：張?jiān)拢?/p>