陳光治　王曉娟　何　燕　王月明　羅卉麗

湖北省十堰市婦幼保健院(442000)

中國每年新發(fā)宮頸癌13萬例且呈現(xiàn)年輕化上升趨勢[1]。目前已知人類乳頭瘤病毒(HPV)感染，特別是高危型別HPV是宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)及宮頸癌的重要誘因[2]。HPV持續(xù)陽性者2年內(nèi)發(fā)生CIN I-II級的風(fēng)險(xiǎn)為28%，其中3%會在今后10年內(nèi)繼續(xù)發(fā)展為宮頸癌[3]。目前較為明確的高危型別HPV是HPV 16和HPV 18[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)HPV感染可以造成人類染色體端粒酶基因(hTERC)重新激活，其過表達(dá)則可導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生[5]。Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子(FOXM1)和C-myc癌基因(C-myc)作為調(diào)控細(xì)胞周期的原癌基因，也在腫瘤的病理改變過程起到促進(jìn)作用，均共同調(diào)控腫瘤的生長侵襲與轉(zhuǎn)移[6]。目前將FFOXM1、hTERC、C-myc結(jié)合應(yīng)用于HPV陽性宮頸癌患者的檢測價(jià)值尚不明確。本研究選擇這3種標(biāo)志物作為HPV陽性的宮頸癌診斷標(biāo)志物，檢測并評估其臨床篩查意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，經(jīng)研究對象簽署知情同意書后標(biāo)本采集。選擇2015年1月-2016年1月在本院婦產(chǎn)科接受HPV檢測且陽性婦女360例。其中，經(jīng)病理確診為宮頸癌患者120例(宮頸癌組)，年齡43.4±8.2歲，按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO 2010)制定的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為IA2 期35例、IB1期30例、IB2期31例、IIA1 期12例、IIA2期12例；CIN I-III期患者120例(CIN組)，其中I期45例、II期40例、III期35例，年齡42.2±9.5歲；良性子宮頸病變者120例(對照組)，年齡43.8±6.9歲。上述病理學(xué)診斷依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]標(biāo)準(zhǔn)分型。

1.2 基因檢測方法及陽性判斷

取患者宮頸組織切片在恒溫水浴箱內(nèi)展開后取出標(biāo)記，將免疫組化染色片冷切后放入-80 ℃冰箱備用。準(zhǔn)備FOXM1、hTERC與C-myc相應(yīng)的已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)做陰性對照。采用免疫組織化學(xué)法，即用型免疫組化MaxVision檢測試劑盒(福州邁新)檢測FOXM1、hTERC與C-myc表達(dá)。分別由病理科兩位醫(yī)生鏡下閱片，根據(jù)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比例及細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷：①無陽性細(xì)胞或細(xì)胞染色為淺黃色或棕黃色，或陽性細(xì)胞比例<25%，染色為淺黃色為陰性；②陽性細(xì)胞比例為25%～50%，或比例<25%但染色為棕黃色為陽性(+)；③陽性細(xì)胞比例>50%，或比例為25%～50%染色為棕褐色，或比例25%～50%但染色為棕黃色為陽性(++),其中(+)和 (++)均記錄為陽性[8]。PCR+膜倒流雜交法[凱普HPV(21型)核酸分型檢測試劑盒提供]檢測HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68等14種高危型別，1種疑似高危型別HPV53，6種低危型別HPV6、11、42、43、44，CP8304(81)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS2.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，用例數(shù)及百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，用Spearman秩相關(guān)分析各個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種基因在HPV陽性不同宮頸組織中表達(dá)

FOXM1、hTERC、C-myc三者的陽性率在HPV陽性者的宮頸正常組織、CIN組織與宮頸癌組織標(biāo)本中存在差異(P<0.05)，在宮頸癌組織中均出現(xiàn)了高表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)水平最低。見表1。

表1　HPV陽性者不同宮頸組織中各基因表達(dá)情況[例(%)]

*與正常組織比較#與CIN組織比較P<0.05

2.2 宮頸癌組織中FOXM1、hTERC與C-myc表達(dá)的相關(guān)性

120例宮頸癌組織標(biāo)本中： FOXM1陽性88例，與C-myc共表達(dá)陽性62例，二者共表達(dá)陰性17例，秩相關(guān)分析顯示FOXM1與C-myc表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.227,P=0.024)；FOXM1與hTERC共表達(dá)陽性58例，二者共表達(dá)陰性22例。秩相關(guān)分析顯示FOXM1與hTERC表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.317,P=0.035)；C-my陽性77例，與hTERC共表達(dá)陽性60例，二者共表達(dá)陰性35例。秩相關(guān)分析顯示C-myc與hTERC表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.356,P=0.014)。具體見表2。宮頸CIN組織和正常組織中未發(fā)現(xiàn)FOXM1、hTERC與C-myc三者間表達(dá)有相關(guān)性。

表2　宮頸癌組織中FOXM1、hTERC、C-myc表達(dá)的情況(例)

2.3 HPV陽性宮頸癌組織中基因表達(dá)與臨床因素的關(guān)系

FOXM1的表達(dá)與年齡、脈管侵犯無關(guān)，與浸潤深度、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；hTERC的表達(dá)與年齡、臨床分期、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與浸潤深度、分化程度及有關(guān)(P<0.05)；C-myc的表達(dá)與年齡、脈管侵犯、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與浸潤深度有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3　宮頸癌組織中基因表達(dá)與臨床因素的關(guān)系[例(%)]

*組間比較P<0.05

3 討論

中國作為宮頸癌的高發(fā)國，這一惡性腫瘤嚴(yán)重地危害著我國女性的身心健康。如今宮頸癌治療重點(diǎn)在于防治，HPV檢測是宮頸癌篩查的首選方案[8]。細(xì)胞學(xué)檢查是HPV陽性的分檢方法，由于HPV檢測敏感性不高、特異性低，亟需探究HPV陽性篩查方法[9]。本研究結(jié)果提示FOXM1、hTERC與C-myc在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用，有可能作為HPV陽性者宮頸癌的篩查及預(yù)后評估的標(biāo)志物。

3.1 FOXM1基因的作用

盡管目前FOXM1誘導(dǎo)腫瘤生長的機(jī)制尚未明確，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其與多個(gè)信號通路相關(guān)，特別是細(xì)胞周期相關(guān)信號通路[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1在宮頸癌多個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)高于永生化的正常宮頸上皮細(xì)胞，表明FOXM1可能參與CIN進(jìn)一步的癌變。而且FOXM1在其他類別腫瘤中的研究[12-15]也發(fā)現(xiàn)，其與肺癌、喉癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等密切相關(guān)。這與本研究發(fā)現(xiàn)的FOXM1蛋白表達(dá)與浸潤深度、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征有關(guān)相一致。

3.2 hTERC基因的作用

本研究中發(fā)現(xiàn)，hTERC基因陽性表達(dá)與宮頸癌的分化、浸潤深度密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯等有關(guān)?？紤]可能HPV感染后，病毒整合導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，致癌基因編碼的原癌蛋白表達(dá)促使hTERC基因表達(dá)。已有研究[16]表明hTERC基因與HPV感染高度相關(guān)，可能HPV感染啟動端粒酶基因重新激活，二者共同作用促進(jìn)宮頸癌變細(xì)胞增殖。有研究[17]結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTERC基因陽性擴(kuò)增與HPV陽性率正相關(guān)，且隨著組織學(xué)病變程度加重，表達(dá)呈現(xiàn)增加趨勢，提示hTERC基因的異常表達(dá)可能預(yù)示著宮頸早期病變。

3.3 C-myc基因的作用

在卵巢癌和乳腺癌的研究[18-19]中，C-myc被發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生早期的事件觸發(fā)上起到的影響比較大，而對預(yù)后影響較小。這也支持了本文研究的結(jié)果：C-myc的表達(dá)只與浸潤深度有關(guān)。考慮可能因?yàn)樵┗駽-myc參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，作為核轉(zhuǎn)錄因子通過編碼蛋白質(zhì)結(jié)合DNA鏈調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。當(dāng)其過度表達(dá)時(shí)，可引發(fā)細(xì)胞過度增殖且協(xié)同其他癌基因，造成細(xì)胞惡變[20]。

3.4 3種基因的相互作用

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1、hTERC與C-myc三者之間表達(dá)兩兩相關(guān)，提示這三者之間可能存在協(xié)同作用。C-myc是周期調(diào)控蛋白FOXM1的下游靶基因，二者共同調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖和凋亡。有研究[20]提示，二者的作用機(jī)制可能是通過5′-AC/T-AAA-C/T-AA-3′結(jié)合發(fā)揮作用，或可能是FOXM1結(jié)合TATA盒，轉(zhuǎn)錄活化C-myc。而這二者在癌變過程中可能進(jìn)一步促發(fā)了細(xì)胞分裂過程中的端粒酶基因的過表達(dá)。

綜上所述，F(xiàn)OXM1、hTERC與C-myc在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用，有可能作為HPV陽性宮頸癌的篩查及預(yù)后評估的標(biāo)志物。但這三者之間的具體相互作用機(jī)制尚不明確， HPV如何激活FOXM1、hTERC與C-myc還有待進(jìn)一步深入研究。