唐 林，韋敏克，韋建勛，柳 達(dá)

1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣西壯族自治區(qū) 530021

2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科，遼寧 110000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作為絕經(jīng)后女性的常見病和多發(fā)病，發(fā)生率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康［1］。該病是由于雌激素缺乏而導(dǎo)致骨代謝異常的一種全身性骨骼疾?。?］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）作為機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，廣泛存在于人體多種器官、組織中，廣泛參與機(jī)體多項生理功能［3］，血管緊張素Ⅱ作為RAS主要的活性肽類物質(zhì)，可與其受體結(jié)合在心血管疾病、先兆子癇、血管排斥反應(yīng)等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，RAS組分存在于骨組織中，且在骨骼代謝、骨細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮重要作用［5］。Shuai等［6］指出，腰椎椎間盤突出癥患者腰椎骨小梁中存在RAS組分，且與骨密度和骨代謝密切相關(guān)。本研究擬對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠進(jìn)行血管緊張素Ⅱ受體抑制劑干預(yù)，探討其對腰椎骨組織的影響及可能的機(jī)制，以期為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料和設(shè)備

氯沙坦購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字H20080371），小鼠雌二醇檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（PICP）檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；小鼠骨鈣蛋白（OCN）檢測試劑盒購自北京冬歌生物科技有限公司；血清鈣檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒購自Gibco公司；骨保護(hù)素（OPG）、核因子κB受體活化因子（RANK）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）及內(nèi)參引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2　實驗動物

SPF級雌性小鼠（Balb/c）60只購自河南省實驗動物中心［合格證號SCXK（豫）2010-0002］，8周齡，體質(zhì)量（21.2±2.0）g。利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為假手術(shù)組、模型組和氯沙坦治療組，每組20只。3組小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定，無菌操作，取背側(cè)正中切口，模型組和氯沙坦治療組均將雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除，假手術(shù)組只切除雙側(cè)卵巢周圍與卵巢等重的脂肪組織。術(shù)后第5天起對小鼠進(jìn)行陰道涂片，每日1次，持續(xù)5 d，以未發(fā)現(xiàn)角化作為建模成功［7］。術(shù)后第7 天開始假手術(shù)組和模型組小鼠每天灌服0.5 mL生理鹽水，氯沙坦治療組小鼠按照10 mg/（kg·d）的劑量灌服氯沙坦水溶液0.5 mL［8］。3組小鼠術(shù)后均未用抗生素，自由活動，喂養(yǎng)于相同條件下，連續(xù)處理至術(shù)后12周，均未出現(xiàn)死亡。

1.3　小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平檢測

各組小鼠分別于建模后8周和12周時采血，采血前10 h禁食但不禁水。各組小鼠均于內(nèi)眥靜脈叢采血0.4 mL，室溫下靜置60 min，3 000 r/min離心10 min，留取血清保存于-30℃冰箱以備檢。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對血清中雌二醇、ALP、OCN和PICP水平進(jìn)行檢測，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實驗室按照試劑盒說明完成。

1.4　小鼠腰椎骨形態(tài)計量學(xué)檢測和三維形態(tài)重構(gòu)

各組小鼠均于建模后12周取血后采用頸椎脫臼法處死，將下段腰椎取出，除去肌肉及軟組織，利用美國GE公司Micro-CT三維成像系統(tǒng)對小鼠L4椎體進(jìn)行骨形態(tài)計量學(xué)檢測和三維形態(tài)重構(gòu)。分析指標(biāo)包括骨密度（BMD）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁間隙（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）。

1.5　小鼠腰椎組織中OPG、RANK和RANKL表達(dá)檢測

取各組小鼠L5椎骨組織，研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)移至勻漿器中，加入TRIzol總RNA提取試劑，冷凍勻漿后，置于滅菌離心管中，室溫下于320×g（g=9.806 65 m/s2）離心6 min，取上清。加入氯仿，充分混勻，靜置2 min，于4℃條件下12 000×g離心10 min，取上清，加入異丙醇，混勻，于-20℃冰箱放置15 min，于4℃條件下12 000×g離心10 min，獲得白色沉淀即為RNA。取白色沉淀，加入75%乙醇，于4℃條件下12 000×g離心5 min，去除液體，將離心管放置在超凈臺上吹4 min，加入無RNA酶的水對RNA進(jìn)行溶解。利用紫外分光光度計對總RNA純度進(jìn)行檢測，取D260/D280≥1.80作為合格樣品。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法 獲 得 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK和RANKL相對表達(dá)量［9］。

表1　引物序列Tab. 1 Primer sequence

1.6　統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，數(shù)據(jù)以表示，3組間比較采用F檢驗，如組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。不同時間點資料比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較

3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平見表2。與假手術(shù)組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠8周、12周時血清雌二醇水平均降低；模型組小鼠8周、12周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高；氯沙坦治療組小鼠8周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，氯沙坦治療組8周、12周時小鼠血清ALP、OCN和PICP水平差異均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與8周時相比，模型組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高，氯沙坦治療組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2　3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結(jié)果比較

3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結(jié)果見表3。與假手術(shù)組相比，模型組和氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低，而Tb.Sp和SMI均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組相比，氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高，而Tb.Sp和SMI均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。三維重建圖像顯示，模型組小鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁變疏松，連接性變差，多呈棒狀結(jié)構(gòu)，局部出現(xiàn)較大空隙；氯沙坦治療組小鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)改善明顯，骨小梁數(shù)量增多，排列平行，孔隙減少（圖1）。

表2　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol，ALP，OCN and PICP between 3 groupsn=20，

表2　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol，ALP，OCN and PICP between 3 groupsn=20，

注：*與假手術(shù)組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05；▲與8周時相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group；▲P＜ 0.05，compared with 8 weeks

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表3　3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數(shù)Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20，

表3　3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數(shù)Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20，

注：*與假手術(shù)組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group

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圖1　3組小鼠L4Micro-CT掃描三維成像Fig. 1 Micro-CT scan three-dimensional imaging of L4

2.3　3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達(dá)比較

3組 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK、RANKL相對表達(dá)量見表4。與假手術(shù)組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均降低，而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組相比，氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均升高，而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

3　討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與女性絕經(jīng)后雌激素水平下降有關(guān)，切除成年小鼠雙側(cè)卵巢后出現(xiàn)骨代謝異常、骨量丟失，其過程與女性絕經(jīng)后骨代謝改變十分相似［9］。因此，本研究將8周齡小鼠雙側(cè)卵巢切除，建立骨質(zhì)疏松動物模型。ALP作為反映骨代謝狀況的間接指標(biāo)常用于骨形成及骨轉(zhuǎn)換的評價［10］，OCN是反映骨礦化形成的特異性指標(biāo)［11］，PICP則是體現(xiàn)成骨細(xì)胞合成骨膠原能力及骨形成的特異性指標(biāo)［12］。本研究顯示，模型組小鼠8周、12周時血清雌二醇水平均較假手術(shù)組降低，而血清ALP、OCN和PICP水平均升高，表明去除卵巢小鼠骨吸收大于骨形成。采用Micro-CT對3組小鼠腰椎進(jìn)行掃描，模型組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低，而Tb.Sp和SMI均升高；三維成像顯示，模型組腰椎骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁變疏松，連接性變差，多呈棒狀結(jié)構(gòu)，局部出現(xiàn)較大空隙，這些改變均提示采取切除小鼠雙側(cè)卵巢的方法可成功構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。

表4　3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達(dá)比較Tab. 4 Comparison on expressions of OPG，RANK and RANKL in lumbar vertebrae between 3 groupsn=20，

注：*與假手術(shù)組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group

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血管緊張素Ⅱ作為RAS關(guān)鍵性活化物質(zhì)，可抑制成骨細(xì)胞中OPG基因表達(dá)，抑制ALP活性，減少礦化結(jié)節(jié)形成，顯著抑制成骨細(xì)胞礦化能力［13］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可部分改善去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨組織負(fù)轉(zhuǎn)換狀態(tài)［14］。雌激素可抵抗由血管緊張素Ⅱ活化而引發(fā)的骨代謝異常及骨丟失［15］。Zhang等［16］發(fā)現(xiàn)，利用腎素抑制劑阿利吉侖可通過骨骼中血管緊張素Ⅱ和緩激肽受體信號通路而對卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠骨小梁發(fā)揮保護(hù)作用。本研究采用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦對小鼠進(jìn)行灌胃處理，結(jié)果顯示，氯沙坦治療組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均降低，說明氯沙坦灌服可在一定程度上抑制骨吸收。Micro-CT對3組小鼠腰椎進(jìn)行掃描，相關(guān)參數(shù)分析顯示，與模型組相比，氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高，而Tb.Sp和SMI均降低；三維重建圖像顯示，與模型組相比，氯沙坦治療組腰椎骨微結(jié)構(gòu)改善明顯，骨小梁數(shù)量增多、排列平行、孔隙減少，進(jìn)一步說明氯沙坦可有效改善去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)，減少骨轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的骨丟失。

有研究發(fā)現(xiàn)，OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中扮演重要角色，OPG可阻斷RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞形成，減少骨吸收，增加骨質(zhì)和骨量［17］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ可促進(jìn)成骨細(xì)胞中RANKL基因表達(dá)，從而加速細(xì)胞活化、分化［18］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均降低，而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均升高；與模型組相比，氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達(dá)量均升高，而RANKL mRNA相對表達(dá)量和RANKL/OPG比值均降低。提示在使用血管緊張素Ⅱ受體抑制劑氯沙坦干預(yù)后，可通過活化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)，降低RANKL/OPG比值而減少破骨細(xì)胞生成及成熟，從而減少骨流失。

綜上所述，血管緊張素Ⅱ受體抑制劑可能通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收來減少負(fù)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的骨丟失，從而改善去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠腰椎骨組織骨質(zhì)疏松狀態(tài)。