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鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒定性定量方法研究

2018-07-12 07:29張瑞堂金永新張紅梅馬肖何彩虹田新華吳玉瓊
關(guān)鍵詞:芍藥苷薄層色譜法龍膽

張瑞堂 金永新 張紅梅 馬肖 何彩虹 田新華 吳玉瓊

摘要:目的 建立鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒的定性定量方法。方法 采用薄層色譜法鑒別制劑中的龍膽、黃芩、大黃、白芍。采用HPLC對(duì)制劑中的龍膽苦苷、芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定,色譜柱為Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(12∶88),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm(龍膽苦苷)、230 nm(芍藥苷),柱溫為室溫。結(jié)果 薄層色譜能檢出龍膽、黃芩、大黃、白芍。龍膽苦苷在2.396~11.980 ?g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 6),平均加樣回收率為99.72%(RSD=2.70%);芍藥苷在2.728~13.640 ?g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 0),平均加樣回收率為98.74%(RSD=2.42%)。結(jié)論 本研究所建立的方法簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好,可用于控制鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞:鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒;龍膽苦苷;芍藥苷;龍膽;薄層色譜法;高效液相色譜法

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.016

中圖分類號(hào):R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5304(2018)04-0077-05

Abstract: Objective To establish a method for qualitative and quantitative analysis of Zhendian Kaiqiao Granules. Methods Gentiane Radix et Rhizoma, Scuteliariae Radix, Rhei Radix et Rhizoma, Radices Paeoniae Alba in the preparation were identified by TLC. Gentiopicrin and paeoniflorin were determined by HPLC. The analysis was performed on a Phenomenex C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), with the mobile phase of methyl alcohol-water (12:88). The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was maintained at room temperature; the detection wavelengths were set at 273 nm (gentiopicrin) and 230 nm (paeoniflorin). Results Gentiane Radix et Rhizoma, Scuteliariae Radix, Rhei Radix et Rhizoma, Radices Paeoniae Alba could be detected by TLC. Gentiopicrin showed a good linear relationship at a range of 2.396–11.980 ?g, r=0.999 6. The average recovery was 99.72%, and RSD was 2.70%. Paeoniflorin showed a good linear relationship at a range of 2.728–13.640 ?g, r=0.999 0. The average recovery was 98.74%, and RSD was 2.42%. Conclusion The established method is simple, reliable and reproductive. The method can be used for control quality of Zhendian Kaiqiao Granules.

Keywords: Zhendian Kaiqiao Granules; gentiopicrin; paeoniflorin; Gentiane Radix et Rhizoma; TLC identification; HPLC

鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒處方來(lái)源于甘肅省第二人民醫(yī)院(甘肅省精神衛(wèi)生中心)中醫(yī)科,為該院經(jīng)驗(yàn)方,經(jīng)多年臨床使用效果明確、毒副作用小。為使患者攜帶方便,擬開(kāi)發(fā)為醫(yī)院院內(nèi)制劑。該制劑由龍膽、黃芩、白芍、大黃、石膏、生地黃、酸棗仁、龍骨、牡蠣、珍珠母、石決明、琥珀、細(xì)辛、茯苓、甘草共15味藥組成,具有泄肝潛鎮(zhèn)、清泄陽(yáng)明功效,用于治療癲狂癥。為了控制鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒的質(zhì)量,本研究采用薄層色譜方法對(duì)制劑中的龍膽、白芍、黃芩、大黃進(jìn)行定性鑒別,采用HPLC對(duì)制劑中的龍膽苦苷、芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定,為將鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒開(kāi)發(fā)成安全、有效、價(jià)廉的醫(yī)院院內(nèi)制劑提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1120型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫公司),WFH-203三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司),ALC-210.4型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司),JY2002型百分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(天津華鑫儀器廠),B1210E-MT型超聲波儀(美國(guó)Branson公司,功率80 W,頻率50~60 Hz),HH-S26S數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)。

龍膽苦苷對(duì)照品(含量以97.9%計(jì),批號(hào)110736-200731,供含量測(cè)定用)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201438,供含量測(cè)定用)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)120955-201309,供含量測(cè)定用)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)120984-201202,供含量測(cè)定用)、龍膽對(duì)照藥材(批號(hào)121530-200501,供鑒別用)、黃芩對(duì)照藥材(批號(hào)200715-199809,供鑒別用)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)110756-200110,供鑒別用)、白芍對(duì)照藥材(批號(hào)120905-201109,供鑒別用),中國(guó)食品藥品檢定研究院;鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒3批(批號(hào)分別為20160313、20160315、20160317)、龍膽陰性對(duì)照顆粒、黃芩陰性對(duì)照顆粒、大黃陰性對(duì)照顆粒、白芍陰性對(duì)照顆粒,甘肅省第二人民醫(yī)院藥劑科制劑室自制;硅膠G薄層板(批號(hào)20140108),青島海洋化工廠分廠;硅膠GF254薄層板(批號(hào)20151013),青島鼎康硅膠有限公司;甲醇為色譜純,水為純化水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性分析

2.1.1 龍膽的鑒別

取本品顆粒適量,研細(xì)后稱取10 g,加甲醇20 mL,超聲處理(功率80 W,頻率50~60 Hz)20 min,過(guò)濾,濾液于60 ℃水浴蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解,作為供試品溶液[1]。稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量,加甲醇制成濃度約為1 mg/mL的對(duì)照品溶液[2]。分別取龍膽對(duì)照藥材約0.3 g、龍膽陰性對(duì)照顆粒10 g,按供試品溶液制備方法制得龍膽對(duì)照藥材溶液和龍膽陰性對(duì)照溶液。照薄層法色譜法試驗(yàn)(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502),吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、龍膽對(duì)照藥材溶液、龍膽陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干后置紫外燈(254 nm)下檢視[3]。在供試品色譜中與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn),在陰性對(duì)照色譜中無(wú)相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.2 黃芩的鑒別

取本品顆粒適量,研細(xì)后稱取10 g,加乙酸乙酯30 mL、甲醇10 mL,混勻,超聲處理(功率80 W,頻率50~60 Hz)30 min,過(guò)濾,濾液于60 ℃水浴蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液[3]。稱取黃芩苷對(duì)照品適量,加甲醇制成濃度約為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別稱取黃芩對(duì)照藥材約0.3 g、黃芩陰性對(duì)照顆粒10 g,按供試品溶液制備方法制得黃芩對(duì)照藥材溶液和黃芩陰性對(duì)照溶液。照薄層法色譜法試驗(yàn)(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502),吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、黃芩對(duì)照藥材溶液、黃芩陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以5%三氯化鐵乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[4-6]。在供試品色譜中與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn),在陰性對(duì)照色譜中無(wú)相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.3 大黃的鑒別

取本品顆粒適量,研細(xì)后稱取10 g,加乙醚20 mL,超聲處理(功率80 W,頻率50~60 Hz)20 min,過(guò)濾,濾液30 ℃水浴蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液[6-7]。稱取大黃素對(duì)照品適量,加甲醇制成濃度約為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別稱取大黃對(duì)照藥材約0.3 g、大黃陰性對(duì)照顆粒10 g,按供試品溶液制備方法制得大黃對(duì)照藥材溶液和大黃陰性對(duì)照溶液。照薄層法色譜法試驗(yàn)(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502),吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、大黃對(duì)照藥材溶液、大黃陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶2∶0.1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干后置紫外燈(365 nm)下檢視[8-9]。在供試品色譜中與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn),在陰性對(duì)照色譜中無(wú)相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.4 白芍的鑒別

取本品顆粒適量,研細(xì)后稱取10 g,加50 mL水溶解,用水飽和的正丁醇液50 mL萃取2次,合并正丁醇萃取液,用氨試液洗滌2次,每次15 mL,合并正丁醇液,水浴蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解,甲醇溶解液作為供試品溶液[10]。稱取芍藥苷對(duì)照品適量,加甲醇制成濃度約為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別稱取白芍對(duì)照藥材約0.3 g、白芍陰性對(duì)照顆粒10 g,按供試品溶液制備方法制成白芍對(duì)照藥材溶液和白芍陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502),吸取供試樣品溶液、對(duì)照品溶液、白芍對(duì)照藥材溶液、白芍陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶20∶0.2)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[11-15]。在供試品色譜中與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn),在陰性對(duì)照色譜中無(wú)相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件

采用Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6mm,5 μm),預(yù)柱為Shimadzu Shim-pack C18柱(10 mm×4.6 mm),流動(dòng)相為甲醇-水(12∶88),流速為1 mL/min,龍膽苦苷檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm,芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 對(duì)照品混合溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的龍膽苦苷對(duì)照品(含量以97.9%計(jì)算)6.12 mg、芍藥苷對(duì)照品6.82 mg,置10 mL棕色容量瓶中,用流動(dòng)相比例的甲醇水混合液溶解并定容至刻度,即配制成龍膽苦苷、芍藥苷濃度分別為0.599、0.682 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取樣品適量,研細(xì),精密稱取粉末約10 g,置具塞錐形瓶中,加甲醇20 mL,超聲提?。üβ?0 W,頻率50~60 Hz)30 min,過(guò)濾,濾液用甲醇定容至100 mL容量瓶中。精密吸取定容溶液10 mL,蒸干,殘?jiān)?0 mL水溶解,定量轉(zhuǎn)移至25 mL分液漏斗中,加入水飽和的正丁醇萃取3次,每次5 mL,合并正丁醇液,置水浴上蒸干,殘?jiān)昧鲃?dòng)相比例的甲醇水混合液溶解,并定容至5 mL棕色容量瓶中,0.45 μm濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,作為供試品溶液[16]。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

精密稱取龍膽陰性對(duì)照顆粒、白芍陰性對(duì)照顆粒各10 g,混勻,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備,即得陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn)

吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,記錄色譜圖(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明供試品溶液分別在273、230 nm色譜圖中,有與對(duì)照品龍膽苦苷、芍藥苷保留時(shí)間一致的特征峰,保留時(shí)間分別為7.5、9.1 min,陰性對(duì)照溶液色譜圖中無(wú)相應(yīng)特征的吸收峰,表明處方中其他成分對(duì)被測(cè)成分無(wú)干擾,方法專屬性較好。各成分分離度均大于2.0,理論塔板數(shù)以龍膽苦苷、芍藥苷計(jì)算均不低于3000。

2.2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液200、400、500、600、700、800、900、1000 ?L,用流動(dòng)相比例的甲醇水混合液定容至1 mL容量瓶,依次吸取上述溶液各20 ?L,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:龍膽苦苷Y=3.5×10-6X+0.021 2,r=0.999 6;芍藥苷Y=1.0×10-6X+2.768 7,r=0.999 0。結(jié)果表明,龍膽苦苷和芍藥苷分別在2.396~11.980 ?g和2.728~13.640 ?g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液20 ?L,重復(fù)進(jìn)樣5次,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得龍膽苦苷、芍藥苷含量RSD分別為2.09%、2.18%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一份供試品溶液20 ?L,于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h注入高效液相色譜儀,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得龍膽苦苷、芍藥苷含量RSD分別為2.56%、2.42%。結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20160313)6份,分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,龍膽苦苷、芍藥苷的平均含量分別為3.50、4.20 mg/g,RSD分別為2.42%、2.10%。結(jié)果表明本方法的重復(fù)性好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)20160313)1 g,共5份,精密稱定,精密加入一定量的龍膽苦苷、芍藥苷對(duì)照品,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。符合定量分析要求。

2.2.11 樣品含量測(cè)定

取3批樣品,各3份,精密稱定,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算龍膽苦苷、芍藥苷含量,結(jié)果見(jiàn)表2。3批樣品中龍膽苦苷的含量均高于3.0 mg/g,芍藥苷的含量均高于4.0 mg/g。本品含龍膽以龍膽苦苷含量的90%計(jì)不低于2.7 mg/g,含白芍以芍藥苷含量的90%計(jì)不低于3.6 mg/g。

3 討論

黃芩的薄層鑒別曾使用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)黃芩項(xiàng)下薄層鑒別的展開(kāi)劑,供試品溶液斑點(diǎn)分離效果不佳,后采用“2.1.2”項(xiàng)下展開(kāi)劑,并用5%三氯化鐵乙醇溶液顯色,較紫外光燈(365 nm)下觀察斑點(diǎn)更加清晰,分離效果好。

大黃的薄層鑒別曾使用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)大黃項(xiàng)下薄層鑒別的展開(kāi)劑和以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層板,但供試品溶液色譜中斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象,后采用“2.1.3”項(xiàng)下展開(kāi)劑和硅膠G板,置紫外光燈(365 nm)下觀察,分離效果好。

白芍鑒別所用的芍藥苷對(duì)照品溶液應(yīng)新鮮配制,若放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),芍藥苷對(duì)照品薄層色譜會(huì)出現(xiàn)2個(gè)斑點(diǎn),這可能與芍藥苷在乙醇溶液中不穩(wěn)定易分解有關(guān)。白芍的薄層鑒別曾使用2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)白芍項(xiàng)下薄層鑒別的提取方法和展開(kāi)劑,供試品溶液無(wú)與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn),后用“2.1.4”項(xiàng)下樣品處理方法和展開(kāi)劑,5%香草醛硫酸溶液顯色劑顯色后斑點(diǎn)清晰,可用于白芍的鑒別。白芍薄層鑒別色譜圖中,白芍對(duì)照藥材色譜由下至上的第一個(gè)斑點(diǎn)與陰性對(duì)照色譜相對(duì)應(yīng)的位置有相同顏色的斑點(diǎn),但其主要成分芍藥苷與芍藥苷對(duì)照品色譜在同一位置顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照在此位置無(wú)干擾,故該方法可用于本制劑中白芍的鑒別。

龍膽苦苷、芍藥苷含量測(cè)定中,我們?cè)疾炝思状?水(23∶77)[17]、乙腈-水[18]、乙腈-水-醋酸(10∶80∶1)[19]、乙腈-0.05%磷酸[20-21]的流動(dòng)相,結(jié)果表明,用甲醇-水(12∶88)為流動(dòng)相時(shí),分離度、峰形均達(dá)到比較理想的效果。

本研究對(duì)鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒中的龍膽、白芍、黃芩、大黃進(jìn)行了薄層色譜鑒別,并建立了HPLC同時(shí)測(cè)定龍膽苦苷、芍藥苷含量的方法。方法簡(jiǎn)便、可控,可作為鎮(zhèn)癲開(kāi)竅顆粒質(zhì)量控制方法。

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(收稿日期:2017-08-17)

(修回日期:2017-09-14;編輯:陳靜)

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