張源源 方家林 黃肖 李維國 安澤偉

摘要：【目的】明確形成三倍體橡膠樹云研77-2和云研77-4的2n配子來源及發(fā)生途徑，為利用天然2n配子雜交選育多倍體新品種提供參考?！痉椒ā恳匀扼w橡膠樹云研77-2和云研77-4及其親本為試驗材料，通過SSR分子標記鑒定其2n配子來源及發(fā)生途徑，并分析2n配子傳遞親本的雜合性。【結果】分別通過4個位點可判定形成云研77-2和云研77-4的2n配子來源于母本GT1，無位點判定2n配子來源于父本PR107。從8個位點判定形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為第一次減數(shù)分裂核復原（FDR），從2個位點判定形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為第二次減數(shù)分裂核復原（SDR），形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為FDR的概率為80.00%。從8個位點判定形成云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為FDR，從3個位點判定形成云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為SDR，形成云研77-4的2n配子的發(fā)生途徑為FDR的概率為72.73%。形成云研77-2和云研77-4的2n配子分別傳遞親本60%和70%的雜合性。【結論】形成云研77-2和云研77-4的2n配子均來源于母本GT1，且其發(fā)生途徑均為FDR。

關鍵詞： 橡膠樹；三倍體；2n配子；發(fā)生途徑；第一次減數(shù)分裂核復原（FDR）；第二次減數(shù)分裂核復原（SDR）

中圖分類號： S794.104 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）02-0208-06

Abstract：【Objective】The sources and formation pathway of 2n gametes which formed triploid rubber trees Yunyan 77-2 and Yunyan 77-4 were studied to provide reference for hybridization breeding of polyploid new varieties using natural 2n gametes. 【Method】Triploid rubber trees Yunyan 77-2， Yunyan 77-4 and their parents were used as test materials. The sources and formation pathway of 2n gametes were identified by SSR markers， and heterozygosity of transfer parents of 2n gametes were analyzed. 【Result】Sources of 2n gametes which formed Yunyan 77-2 and Yunyan 77-4 derived from female parent GT1 were identified by four loci respectively，while there was no locus which determined that 2n gametes derived from male parent PR107. Eight loci determined that the formation pathway of 2n gametes which formed Yunyan 77-2 was the first division restitution（FDR），two loci determined that the formation pathway of 2n gametes which formed Yunyan 77-2 was second division restitution（SDR）. The probability of 2n gamete forming Yunyan 77-2 through FDR was 80.00%. Eight loci determined that the formation pathway of 2n gametes which formed Yunyan 77-4 was FDR，three loci determined that the formation pathway was SDR，the probability of 2n gamete forming Yunyan 77-4 through FDR was 72.73%. The 2n gametes which formed Yunyan 77-2 and Yunyan 77-4 transferred 60% and 70% heterozygosity of the pa-rents respectively. 【Conclusion】The 2n gametes which form Yunyan 77-2 and Yunyan 77-4 all originate from the female parent GT1，and the formation pathway of 2n gametes is FDR.

Key words： rubber tree； triploid； 2n gamete； formation pathway； first division restitution（FDR）； second division restitution（SDR）

0 引言

【研究意義】三倍體可通過二倍體和四倍體雜交或未減數(shù)配子（2n配子）雜交獲得（Ramsey and Schemske，1998；吳雪娟等，2016）。根據(jù)遺傳效應不同，2n配子發(fā)生途徑可分為第一次減數(shù)分裂核復原（First division restitution，F(xiàn)DR）和第二次減數(shù)分裂核復原（Second division restitution，SDR）兩種，其中FDR途徑可傳遞親本70%～80%的雜合性，SDR途徑可傳遞親本30%～40%的雜合性（康向陽和王君，2010），傳遞親本雜合性的差異決定了不同發(fā)生途徑2n配子在多倍體育種中具有不同的應用價值。因此，研究橡膠樹三倍體的2n配子來源及發(fā)生途徑對利用其親本開展多倍體育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】分子標記是2n配子來源及發(fā)生途徑鑒定的常用手段之一，通過篩選親本中的雜合性標記位點，對其2n配子中的等位基因配置進行比較分析，可快速確定2n配子的遺傳組成（張正海和康向陽，2006）。Chen等（2008）應用4個SSR標記分析鑒定出柑橘異源三倍體來源于FDR途徑產(chǎn)生的2n雌配子。Ferrante等（2010）通過多個柑橘二倍體親本與四倍體品系雜交獲得了四倍體子代，并應用6個SSR標記研究鑒定其2n配子的發(fā)生途徑，結果發(fā)現(xiàn)不同親本分別通過不同發(fā)生途徑（FDR或SDR）產(chǎn)生雜合或純合的2n配子。Xi等（2012）應用21個SSR標記分析鑒定出3株黑楊異源三倍體均來源于FDR途徑產(chǎn)生的2n雌配子。Dong等（2014）、旻昱等（2017）研究表明，采用少量位于著絲粒附近的低重組率SSR分子標記可檢測青楊雜種多倍體的遺傳組成，也可鑒定出毛白楊雜種三倍體的2n雌配子來源及發(fā)生途徑。Yao等（2016）應用25個SSR標記鑒定出通過SDR途徑產(chǎn)生的2n雌配子是橡膠樹GT1自然授粉子代三倍體的唯一來源。【本研究切入點】橡膠樹云研77-2和云研77-4具有較母本GT1生長速度快、產(chǎn)量高、抗性強（敖碩昌等，1998）和高度不育的特性（李惠波，2006），經(jīng)染色體計數(shù)確認為純合三倍體，是世界上唯一大面積種植且應用于生產(chǎn)的多倍體橡膠樹（李惠波等，2009）。由于橡膠樹純合三倍體的唯一來源途徑是2n配子和n配子雜交，但目前尚無形成云研77-2和云研77-4的2n配子來源及發(fā)生途徑的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以三倍體橡膠樹云研77-2和云研77-4及其親本為試驗材料，通過SSR分子標記鑒定形成其三倍體的2n配子來源及發(fā)生途徑，分析2n配子傳遞親本的雜合性，為解釋云研77-2和云研77-4具有優(yōu)良性狀的原因及利用其親本的2n配子雜交選育多倍體新品種提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為三倍體橡膠樹云研77-2、云研77-4及其母本GT1和父本PR107。云研77-2和云研77-4是從GT1×PR107雙無性系自然授粉的雜交子代中通過苗期耐寒篩選獲得（李惠波等，2009）。高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350）購自天根生化科技（北京）有限公司；Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7 Polymer、GS-500LIZ分子量內標、毛細管電泳10×Buffer和2×Taq Plus PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 稱取云研77-2、云研77-4、母本GT1和父本PR107的嫩葉300 mg，參照高效植物基因組DNA提取試劑盒使用說明提取基因組DNA。

1. 2. 2 SSR引物篩選及合成 通過毛細管電泳檢測，從30對在橡膠樹中具有多態(tài)性位點的引物中，篩選出13對本研究對象中具有多態(tài)性的引物，其序列及文獻來源見表1。引物5'端連接TAMRA、HEX、FAM或ROX熒光標記，并由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴增 反應體系10.0 μL：DNA模板0.5 μL，Taq Plus PCR Master Mix 5.0 μL，10 μmol/L上游引物0.1 μL，10 μmol/L下游引物0.1 μL，無菌水補足10.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。

1. 2. 4 毛細管電泳檢測和SSR分析 4種PCR產(chǎn)物（即連接TAMRA、HEX、FAM和ROX熒光標記）各0.3 μL、分子量內標0.5 μL和去離子甲酰胺9.5 μL混合后加入PCR板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻，于ABI-3730XL基因分析儀上檢測。檢測結果使用GeneMarker V2.20讀取分析。

1. 2. 5 2n配子來源和發(fā)生途徑鑒定 理論上，不考慮無效等位基因和等位基因丟失的情況，三倍體含有提供2n配子親本的2個及以上等位基因。因此，當同一親本所有的基因位點均與三倍體子代含有2個及以上相同等位基因時，可確定該親本為三倍體的2n配子供體。不考慮同源重組的情況下，F(xiàn)DR途徑產(chǎn)生的2n配子含有親本的所有等位基因，SDR途徑產(chǎn)生的2n配子含有親本50%等位基因。因此，確定2n配子來源后，若三倍體在所有的基因位點均含有提供2n配子親本的所有等位基因時，則2n配子發(fā)生為FDR途徑，反之為SDR途徑。如圖1所示，在HSSR013位點，母本GT1等位基因為abc，父本PR107的等位基因為bb，云研77-4的等位基因為abbc，可判斷2n配子來源于母本GT1，且云研77-4含有親本GT1的所有等位基因，可判斷2n配子發(fā)生途徑為FDR。

1. 2. 6 2n配子傳遞親本雜合性分析 在確定2n配子來源及發(fā)生途徑后，可直接讀取2n配子的基因型，計算2n配子傳遞親本的雜合性（Rate of maternal heterozygosity，HR）。2n配子傳遞親本的雜合性計算公式為：

HR（%）=nab/（nab+naa+nbb）×100

其中，n為2n配子數(shù)，ab表示雜合基因型2n配子，aa和bb表示純合基因型2n配子（Xie et al.，2014）。

2 結果與分析

2. 1 基因組DNA提取結果

4個供試材料的基因組DNA濃度為68.55～335.15 ng/μL，OD260/OD280為2.007～2.119，其瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖2）表明，提取的基因組DNA質量較好，條帶完整，可用于后續(xù)試驗。

2. 2 SSR引物篩選結果

毛細管電泳檢測結果表明，從30對引物中篩選出的13對引物在三倍體云研77-2和云研77-4中處于雜合狀態(tài)且在其父母本中具有差異條帶，篩出率為43.33%（表1）。利用13對引物對4個供試材料進行PCR擴增，共擴增出33條差異性條帶，平均每對引物擴增出2.5個條帶，每個位點的等位基因數(shù)為2～3個，其中6個位點有2個等位基因，7個位點有3個等位基因。

2. 3 2n配子來源鑒定結果

如表2所示，通過HB-1、HSSR012、EHB133和EHB177位點可判定形成云研77-2的2n配子來源于母本GT1，通過HB-1、HSSR013、EHB133和EHB177位點可判定形成云研77-4的2n配子來源于母本GT1，其余位點均無法明確判定，無位點可判定2n配子來源于父本PR107。因此，判定云研77-2和云研77-4的2n配子均來源于母本GT1。

2. 4 2n配子發(fā)生途徑鑒定結果

如表2所示，從HSSR013、EHB034、EHB070、EHB087、EHB159、EHB065、unigenge17757和HESR-

055等8個位點可判定形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為FDR，從HSSR012和EHB133位點可判定形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為SDR，因此，形成云研77-2的2n配子發(fā)生途徑為FDR的概率為80.00%。從HSSR006、HSSR013、EHB034、EHB070、EHB087、EHB159、EHB065和HESR055等8個位點可判定形成云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為FDR，HSSR012、EHB133和unigene17757等3個位點可判定形成云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為SDR。因此，形成云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為FDR的概率為72.73%?？梢?，形成云研77-2和云研77-4的2n配子發(fā)生途徑均為FDR。

2. 5 2n配子傳遞親本雜合性分析結果

根據(jù)2n配子傳遞親本雜合性的計算公式計算可得形成云研77-2和云研77-4的2n配子分別傳遞親本60%和70%的雜合性（表3），傳遞親本的雜合性均超過50%，進一步證實形成云研77-2和云研77-4的2n配子發(fā)生途徑為FDR。

3 討論

自1982年胡東瓊等從橡膠樹GT1的子代中分離出三倍體植株以來，從橡膠樹GT1的子代中篩選出三倍體的報道越來越多。張源源（2013）從橡膠樹GT1的自然授粉子代中檢測出3株天然三倍體；Yao等（2016）從橡膠樹GT1與17個候選親本的自然授粉子代中檢測出8株三倍體。本研究材料云研77-2和云研77-4也是從GT1×PR107雙無性系自然授粉的雜交子代中篩選獲得（敖碩昌等，1998；李惠波等，2009）。研究證實，橡膠樹GT1可穩(wěn)定產(chǎn)生2n雌配子（Yao et al.，2016；張源源等，2017），但無直接證據(jù)證明云研77-2和云研77-4的2n配子來自母本GT1。本研究結果表明，形成云研77-2和云研77-4的2n配子均來自母本GT1，且發(fā)生途徑為FDR。這與Yao等（2016）應用SSR分子標記鑒定出2n雌配子是橡膠樹GT1自然授粉子代三倍體的唯一來源，其發(fā)生途徑為SDR的研究結論不同，說明橡膠樹GT1可能通過FDR和SDR兩種途徑產(chǎn)生2n雌配子。

植物多倍體較二倍體除具有倍性優(yōu)勢外更具有雜合性優(yōu)勢（Bingham，1980）。FDR途徑產(chǎn)生的2n配子可傳遞親本70%～80%的雜合性（康向陽和王君，2010），其高效傳遞親本雜合性的特點在育種中具有較高的利用價值（Xi et al.，2012）。前人研究表明，橡膠樹GT1具有較強的抗寒性，尤其是成齡期莖干和莖基具有極強的抗寒能力，但橡膠樹PR107的抗寒性較差，兩者自然授粉的雜種子代三倍體云研77-2和云研77-4的抗寒性優(yōu)于母本GT1和父本PR107，尤其是云研77-4的抗寒性極強（敖碩昌等，1998；李明謙，2005；李惠波，2006；高新生等，2008；劉世紅等，2011）。本研究結果顯示，形成云研77-2和云研77-4的2n配子分別傳遞母本GT1 60%和70%的雜合性。該結論可用于解釋云研77-2和云研77-4，尤其是云研77-4具有較母本GT1生長速度快、產(chǎn)量高、抗性強（敖碩昌等，1998）和高度不育的特性（李惠波，2006）的原因，為利用橡膠樹抗寒優(yōu)良品種GT1為親本選育多倍體新品種提供參考。

通過SSR等不同分子標記可有效分析基因位點的組成，進而鑒定出2n配子的發(fā)生途徑。但如果分子標記檢測位點處發(fā)生了同源重組，則通過該標記位點得出的等位基因配置無法準確代表整條染色體的遺傳組成，導致2n配子發(fā)生途徑判斷失誤（董春波，2015）。本研究結果顯示，從大部分位點可判定形成云研77-2的2n雌配子發(fā)生途徑為FDR，但有部分位點如HSSR012和EHB133在母本中具有多態(tài)性，其2n配子卻表現(xiàn)為純合，會導致2n雌配子發(fā)生途徑誤判為SDR途徑，說明這2個位點在2n雌配子發(fā)生過程中發(fā)生了同源重組，且在形成云研77-2和云研77-4的2n雌配子中均表現(xiàn)為SDR途徑?？梢?，這2個位點具有較高的同源重組發(fā)生頻率，在今后的2n配子發(fā)生途徑研究中應避免使用，以減少誤判概率。

在植物群體遺傳多樣性研究中，足夠的分子標記數(shù)量和樣本數(shù)量是保證結果準確性的先決條件，數(shù)量過少可能導致檢測到的變異偏低，影響結果的準確性（Sjogren and Wyoni，1994）。2n配子發(fā)生途徑鑒定時，檢測的基因位點數(shù)量越多，位點的多態(tài)性越高，因同源重組而導致誤判的概率越?。ǘ翰?，2015），但橡膠樹遺傳背景狹窄（吳春太等，2009），分子標記的多態(tài)性較低，開發(fā)大量的分子標記具有一定的難度，且分子標記數(shù)量的增加會提高試驗成本。針對這些問題，Done等（2014）采用少量位于著絲粒附近的低重組率的SSR分子標記位點來評估青楊雜種多倍體的遺傳組成，旻昱等（2017）利用相同的方法鑒定出毛白楊雜種三倍體的2n雌配子發(fā)生途徑。因此，開發(fā)低重組率的SSR分子標記是今后橡膠樹分子標記研究的重要方向。

4 結論

形成云研77-2和云研77-4的2n配子均來源于母本GT1，且其發(fā)生途徑均為FDR，分別傳遞親本60%和70%的雜合性，解釋了云研77-2和云研77-4具有優(yōu)良性狀原因，為利用優(yōu)良親本的天然2n配子雜交選育多倍體新品種提供參考。

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（責任編輯 陳 燕）