周麗明 韓金多

摘要：【目的】研究馬家柚果酒的發(fā)酵工藝及其抗氧化作用，為馬家柚綜合利用和深加工提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察果汁初始糖度、酵母菌液添加量、焦亞硫酸鉀（K2S2O5）添加量、果汁初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響，確定馬家柚果酒最佳發(fā)酵工藝；對(duì)比分析馬家柚果汁、馬家柚果酒及添加馬家柚葉芽的果酒對(duì)超氧陰離子自由基（[O] ）和過(guò)氧化氫（H2O2）的清除作用?！窘Y(jié)果】影響馬家柚果酒酒精度的因素主次排序?yàn)椋篕2S2O5添加量>果汁初始pH>果汁初始糖度>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>酵母菌液添加量。馬家柚果酒最佳發(fā)酵工藝為果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間18 d，根據(jù)此工藝進(jìn)行發(fā)酵，馬家柚果酒酒精度為14.3%vol。馬家柚果汁、馬家柚果酒及添加馬家柚葉芽的果酒對(duì)[O] 的清除率最高分別為26.6%、34.5%和43.0%，對(duì)H2O2的清除率最高分別為21.7%、29.0%和37.6%?！窘Y(jié)論】正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝能有效發(fā)酵馬家柚果酒，添加馬家柚葉芽可增強(qiáng)馬家柚果酒的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞： 馬家柚；果酒；葉芽；發(fā)酵工藝；抗氧化作用

中圖分類號(hào)： S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）02-0348-06

Abstract：【Objective】The fermentation process and antioxidant effects of Majia pummelo wine were studied in order to provide reference for comprehensive utilization and further processing of Majia pummelo. 【Method】The effects of initial sugar content， additive amount of yeast， additive amount of potassium metabisulfite（K2S2O5）， initial pH of juice， fermentation temperature and fermentation time on alcohol content of Majia pummelo wine were analyzed based on single factor experiment and orthogonal experiment. Then the optimum fermentation process of Majia pummelo wine was determined. The scavenging effects of Majia pummelo juice， Majia pummelo wine and Majia pummelo wine adding buds on superoxide anion free radical（[O] ） and hydrogen peroxide（H2O2）. 【Result】Results indicated that the influence factors on alcohol content of Majia Pummelo wine were in the following order： additive amount of K2S2O5>initial pH of juice>initial sugar content of juice>fermentation temperature>fermentation time>additive amount of yeast. The optimum fermentation process of Majia pummelo wine was as follows： initial sugar content of juice was 22%， additive amount of yeast 2%， additive amount of K2S2O5 120 mg/mL， initial pH of juice 4.0， fermentation temperature 30 ℃ and fermentation time 18 d. Under this process， the alcohol content of Majia pummelo wine was 14.3%vol. The maximum scavenging rates of Majia pummelo juice， Majia pummelo wine and Majia pummelo wine added buds to [O] were 26.6%， 34.5% and 43.0% respectively. The maximum scavenging rates of Majia pummelo juice， Majia pummelo wine and Majia pummelo wine adding buds to H2O2 were 21.7%， 29.0% and 37.6% respectively. 【Conclusion】The fermentation process optimized by orthogonal experiment is efficient to ferment Majia pummelo wine. The antioxidant effects of Majia Pummelo wine is improved when the buds of Majia pummelo are added.

Key words： Majia pummelo； wine； bud； fermentation process； antioxidant effect

0 引言

【研究意義】柚在Swingle分類系統(tǒng)中為真正柑橘類16個(gè)種之一，也是我國(guó)古老柑橘栽培種類之一（曹立新，2012）。馬家柚因母樹(shù)位于江西省上饒市廣豐區(qū)大南鎮(zhèn)馬家自然村而得名，樹(shù)齡近200年，是一個(gè)抗凍、耐貯、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的地方品種（徐振宇和曹泉，2010；徐常清等，2015）。馬家柚皮具有消食、和胃、理氣、化痰、解酒毒等功效；果肉中含有以β-檸檬烯為主的揮發(fā)性香氣成分和以柚皮苷為主的黃酮類生物活性成分而具有保健功能；皮渣富含果膠；花有類似茉莉花香味，可用于生產(chǎn)花茶和花油；柚子核中所含檸檬苦素類化合物具有一定的抗焦慮鎮(zhèn)靜（Tundis et al.，2014）、鎮(zhèn)痛消炎（Lü et al.，2015）及抗癌、抗病毒（萬(wàn)春鵬等，2016）等作用。果酒是以植物果實(shí)為原料，經(jīng)破碎、壓榨取汁、滅菌、發(fā)酵等工藝釀制而成的一種具有果香味的低度酒精飲料（張春陽(yáng)等，2014）。果實(shí)中的營(yíng)養(yǎng)成分在發(fā)酵過(guò)程中大部分被保留下來(lái)，使得果酒具有低酒精度、低糖度、高營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)（鄭鳳錦等，2016；吳翔等，2017）。若能以馬家柚為原料釀造果酒，不僅可以豐富水果產(chǎn)品種類，滿足消費(fèi)者的多樣化需求，還能解決馬家柚貯存、附加值低等難題，增加就業(yè)崗位，推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于馬家柚栽培和果實(shí)品質(zhì)等方面的研究已有一些報(bào)道。毛祥青等（2010）研究了馬家柚的栽培技術(shù)，曹立新（2012）分析了馬家柚的起源，吳方方等（2012）、靳瑞霞（2013）研究了授粉組合對(duì)馬家柚果實(shí)品質(zhì)的影響，王齊發(fā)等（2015）對(duì)馬家柚的采收和保鮮貯藏進(jìn)行了研究，萬(wàn)春鵬等（2016）對(duì)馬家柚果肉成分進(jìn)行了測(cè)定分析，張涓涓（2016）研究了馬家柚及其變異品系果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育特性差異，管建豐等（2017）研究了氣象條件與馬家柚轉(zhuǎn)色的關(guān)系。對(duì)于柚子葉芽成分的研究，郭剛軍等（2013）、蘆燕玲等（2014）采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)西雙版納的柚子葉化學(xué)成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，柚子葉中主要含有烯、醇、酮、醛、酸、酯及氧化物類化合物。關(guān)于各類果酒發(fā)酵工藝的研究也有一些報(bào)道，王孝榮等（2014）研究了SO2添加量、酵母添加量、發(fā)酵溫度等因素對(duì)草莓果酒釀造的影響；劉靜等（2017）研究了酵母接種量、發(fā)酵溫度、初始糖度等因素對(duì)咖啡果果酒發(fā)酵的影響；吳均等（2017）研究了發(fā)酵溫度、SO2添加量、果酒干酵母添加量、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)紅肉蜜柚果酒發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響果酒發(fā)酵的因素至少有6種，影響因素的主次排序因發(fā)酵果酒種類不同而有所差異。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于馬家柚果酒發(fā)酵工藝及其抗氧化作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以馬家柚為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察果汁初始糖度、酵母菌液添加量、焦亞硫酸鉀（K2S2O5）添加量、果汁初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響，確定馬家柚果酒最佳發(fā)酵工藝；對(duì)比分析馬家柚果汁、馬家柚果酒和添加馬家柚葉芽的馬家柚果酒對(duì)超氧陰離子自由基（[O][2] ）、過(guò)氧化氫（H2O2）的清除作用，為今后馬家柚的綜合利用和深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

馬家柚及其葉芽采于江西省東籬柚業(yè)科技有限公司。釀酒酵母采用葡萄酒酵母，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；食品級(jí)果膠酶和纖維素購(gòu)自寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；食品級(jí)K2S2O5購(gòu)自河南華江生物科技有限公司；蔗糖為市售，檸檬酸和碳酸鈣為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：MB-1118米技果汁機(jī)[米技炫尚智能家用電器（上海）有限公司]，酒精計(jì)（河北省武強(qiáng)縣華洋儀表廠），LH-T50糖度計(jì)（杭州陸恒生物科技有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江西博力儀器設(shè)備有限公司），320-S型pH計(jì)[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]，MJ-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱（上海三科儀器有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 馬家柚果酒發(fā)酵工藝流程 馬家柚果肉?榨汁?添加纖維素酶、果膠酶（各0.01%，50 ℃保溫2 h）?4層紗布過(guò)濾?調(diào)酸、調(diào)糖?巴氏滅菌?降溫?添加K2S2O5和活化后的釀酒酵母?發(fā)酵?8層紗布過(guò)濾?巴氏滅菌?降溫后測(cè)定酒精度。

1. 2. 2 活化酵母菌 參照楊雅利等（2012）的方法活化酵母菌，制得酵母菌液。

1. 2. 3 果酒酒精度測(cè)定 參照GB/T 15038—2006中的酒精計(jì)法測(cè)定。

1. 2. 4 馬家柚果酒發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn) 考察馬家柚果汁初始糖度（18%、20%、22%、24%和26%）、酵母菌液添加量（v/v）（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%、2.5%）、K2S2O5添加量（60、90、120、150和180 mg/L）、果汁初始pH（3.5、4.0、4.5、5.0和5.5）、發(fā)酵溫度（24、26、28、30和32 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（10、12、14、16和18 d）等因素對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響。

1. 2. 5 馬家柚果酒發(fā)酵條件的正交試驗(yàn) 以馬家柚果酒酒精度為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行6因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化馬家柚果酒發(fā)酵工藝。

1. 2. 6 添加馬家柚葉芽的果酒制作方法 在馬家柚果肉中添加果肉質(zhì)量10%洗凈瀝干的馬家柚葉芽，按照1.2.1處理，得到添加馬家柚葉芽的果酒。

1. 2. 7 馬家柚果汁、果酒和添加馬家柚葉芽的果酒抗氧化作用比較 將按照1.2.1操作但未經(jīng)發(fā)酵的馬家柚果汁、經(jīng)最佳發(fā)酵工藝制作的馬家柚果酒和添加馬家柚葉芽的果酒均分別稀釋至1/2和1/4，取稀釋后的各濃度溶液1.0 mL，參照周麗明等（2012）的方法測(cè)定各溶液對(duì)[O][2] 和H2O2的清除率。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 果汁初始糖度對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響

由圖1可知，在酵母菌液添加量1.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 d的條件下，馬家柚果酒酒精度隨果汁初始糖度的增加呈先緩慢上升后快速下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)果汁初始糖度為22%時(shí)果酒酒精度達(dá)最大值（13.6%vol）。這可能是因?yàn)楣跏继嵌容^低時(shí)，酵母菌可用來(lái)轉(zhuǎn)化為酒精的糖較少，造成酒精度較低，且隨著糖度增加酒精度緩慢增加；當(dāng)果汁初始糖度較高時(shí)，果汁水活度降低，滲透壓較高，造成酵母菌生長(zhǎng)緩慢，菌數(shù)較少，酒精度快速下降。因此，選擇果汁初始糖度為22%。

2. 1. 2 酵母菌液添加量對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響 由圖2可知，在果汁初始糖度22%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 d的條件下，當(dāng)酵母菌液添加量為0.5%時(shí)，馬家柚果酒酒精度為13.4%vol，添加量增至2.0%時(shí)，果酒酒精度達(dá)最大值（13.8%vol）。馬家柚果酒酒精度隨酵母菌液添加量的增加有一定程度變化，但變化幅度較小。在發(fā)酵過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，酵母菌液添加量少時(shí)，起酵時(shí)間較晚；而酵母菌液添加量增多時(shí)，起酵時(shí)間提前，果酒顏色略深。這可能是果汁溶氧量成為酵母菌生長(zhǎng)的限制因素，從而影響酒精的產(chǎn)生，造成酒精度隨酵母菌液添加量增加的變化幅度不大。因此，選擇酵母菌液添加量為2.0%。

2. 1. 3 K2S2O5添加量對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響

由圖3可知，在果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 d的條件下，馬家柚果酒酒精度隨K2S2O5添加量的增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)K2S2O5添加量為120 mg/L時(shí)，馬家柚果酒酒精度達(dá)最大值。K2S2O5在果酒釀造中具有殺菌、抗氧化和護(hù)色作用（吳均等，2017），其添加量較少時(shí)，對(duì)雜菌無(wú)明顯抑制效果，造成雜菌生長(zhǎng)，消耗部分糖，減少了酒精生成；K2S2O5添加量較多時(shí)，在抑制雜菌生長(zhǎng)的同時(shí)抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，致使酒精生成減少。因此，選擇K2S2O5添加量為120 mg/L。

2. 1. 4 果汁初始pH對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響

由圖4可知，在果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間16 d的條件下，馬家柚果酒酒精度隨果汁初始pH的增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)果汁初始pH為4.0時(shí)，馬家柚果酒酒精度達(dá)最大值。果汁初始pH過(guò)高或過(guò)低均不利于酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵。因此，選擇果汁初始pH為4.0。

2. 1. 5 發(fā)酵溫度對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響 由圖5可知，在果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵時(shí)間16 d的條件下，馬家柚果酒酒精度隨發(fā)酵溫度的升高呈先升后降的變化趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，馬家柚果酒酒精度達(dá)最大值。溫度較低時(shí)，升高發(fā)酵溫度能增加酶促反應(yīng)速率，提高酒精產(chǎn)量；溫度過(guò)高會(huì)降低生化反應(yīng)中酶活性，從而降低酒精產(chǎn)量。因此，選擇發(fā)酵溫度為30 ℃。

2. 1. 6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響 由圖6可知，在果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，發(fā)酵10～16 d時(shí)，馬家柚果酒酒精度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，發(fā)酵16 d后果酒酒精度的增加趨勢(shì)趨于平緩，主要是因?yàn)榘l(fā)酵液中的糖基質(zhì)已基本消耗。

2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，影響馬家柚果酒酒精度的因素主次排序?yàn)镵2S2O5添加量>果汁初始pH>果汁初始糖度>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>酵母菌液添加量。馬家柚果酒的最佳發(fā)酵工藝組合為A2B2C2D2E2F3，即果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間18 d，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，馬家柚果酒酒精度為14.3%vol，高于所有正交試驗(yàn)組合的酒精度，故確定通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的條件為馬家柚果酒發(fā)酵的最佳工藝。

2. 3 馬家柚果汁、馬家柚果酒和添加馬家柚葉芽的果酒的抗氧化作用比較結(jié)果

不同濃度馬家柚果汁、馬家柚果酒和添加馬家柚葉芽的果酒對(duì)[O][2] 和H2O2的清除率分別見(jiàn)圖7和圖8，由此可以看出3種飲料對(duì)[O][2] 和H2O2均有一定的清除作用，且清除率隨3種飲料濃度的增加而增加。馬家柚果汁對(duì)[O][2] 的清除率最高為26.6%，對(duì)H2O2的清除率最高為21.7%；馬家柚果酒對(duì)[O][2] 的清除率最高為34.5%，對(duì)H2O2的清除率最高為29.0%；添加葉芽的馬家柚果酒對(duì)[O][2] 的清除率最高為43.0%，對(duì)H2O2的清除率最高為37.6%。添加葉芽的馬家柚果酒對(duì)[O][2] 和H2O2的清除率高于同濃度的馬家柚果酒和果汁。

3 討論

影響果酒發(fā)酵的因素較多，但在研究果酒發(fā)酵工藝時(shí)大多僅考察SO2添加量、酵母添加量、發(fā)酵溫度、初始糖度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH等因素中的部分因素（王孝榮等，2014；李志友和李啟要，2016；吳均等，2017；袁敏等，2017）。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察果汁初始糖度、酵母菌液添加量、K2S2O5添加量、果汁初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)馬家柚果酒酒精度的影響，結(jié)果表明，K2S2O5添加量的影響最大，酵母菌液添加量的影響最小，與李敏杰和熊亞（2017）的研究結(jié)果相似。這可能是K2S2O5能夠抑制酵母菌的生長(zhǎng)，從而嚴(yán)重影響果酒發(fā)酵；在K2S2O5定量添加情況下，果汁溶氧量成為酵母菌生長(zhǎng)的限制因素，從而使酵母菌液添加量影響最小。優(yōu)化得到馬家柚果酒最佳發(fā)酵工藝為果汁初始糖度22%、酵母菌液添加量2.0%、K2S2O5添加量120 mg/L、果汁初始pH 4.0、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間18 d，利用此工藝進(jìn)行發(fā)酵，馬家柚果酒酒精度為14.3%vol。

焦揚(yáng)等（2015）采用DPPH、ABTS、H2O2/Fe2+/水楊酸和[O][2] 清除體系考察了3種野生漿果果酒的抗氧化能力，李雪等（2017）采用DPPH自由基、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基清除體系和對(duì)Fe3+還原能力考察了仙人掌果酒的抗氧化能力，結(jié)果均表明，果酒具有較強(qiáng)的抗氧化生物功能。為了加強(qiáng)馬家柚的綜合利用及增強(qiáng)馬家柚果酒的抗氧化活性，本研究考察了馬家柚葉芽對(duì)馬家柚果酒抗氧化性的促進(jìn)作用，結(jié)果表明，馬家柚果汁、馬家柚果酒和添加馬家柚葉芽的果酒對(duì)[O][2] 和H2O2均有一定的清除作用，且清除率隨著果汁或果酒濃度的增加而增加。馬家柚果酒對(duì)[O][2] 和H2O2的清除率均高于同濃度的馬家柚果汁，可能是在發(fā)酵過(guò)程中馬家柚果汁的抗氧化活性成分更好地溶出，也可能是在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌代謝產(chǎn)生抗氧化性物質(zhì)。添加馬家柚葉芽的果酒對(duì)[O][2] 和H2O2的清除率均高于同濃度的馬家柚果酒，可能是在酶作用、發(fā)酵過(guò)程中馬家柚葉芽經(jīng)酵母菌發(fā)酵及酒精的浸泡作用，馬家柚葉芽中的一些化學(xué)成分溶于果酒，且馬家柚葉芽中的化學(xué)成分經(jīng)酵母菌作用還原性增加。說(shuō)明通過(guò)添加馬家柚葉芽可增強(qiáng)馬家柚果酒的抗氧化活性。

本研究初步分析了馬家柚果汁和果酒對(duì)[O][2] 和H2O2的清除作用，并創(chuàng)新性通過(guò)添加馬家柚葉芽以增強(qiáng)馬家柚果酒的抗氧化活性，但尚未明確馬家柚葉芽中的抗氧化物質(zhì)，下一步將分析馬家柚果汁、果酒和馬家柚葉芽中的化學(xué)成分，以期發(fā)現(xiàn)其中具有抗氧化性的生物活性物質(zhì)。

4 結(jié)論

正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝能有效發(fā)酵馬家柚果酒，添加馬家柚葉芽可增強(qiáng)馬家柚果酒的抗氧化作用。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）