金新萍 謝倩 呂斌 曹詣斌

摘要：【目的】克隆金魚(yú)熱激同源蛋白70（HSC70）和熱休克蛋白（HSP40）基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白，明確HSC70和HSP40蛋白的生物學(xué)功能，為揭示金魚(yú)的高溫應(yīng)答機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻崛〗痿~(yú)鰓組織總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增金魚(yú)HSC70和HSP40基因，將目的基因片段克隆至線性空表達(dá)載體pET-32a上構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta表達(dá)菌株后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并以SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)分析表達(dá)獲得的融合蛋白。【結(jié)果】金魚(yú)HSC70基因CDS序列全長(zhǎng)1950 bp，編碼650個(gè)氨基酸；金魚(yú)HSP40基因CDS序列全長(zhǎng)996 bp，編碼332個(gè)氨基酸。金魚(yú)HSC70氨基酸序列與斑馬魚(yú)、人類、家鼠、金線鲃和草魚(yú)的相似度分別為96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%；HSP40氨基酸序列與斑馬魚(yú)的完全一致（相似度100.00%），與普通鯉魚(yú)、金線鲃、人類和家鼠的相似度均為94.12%。原核誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40為可溶性表達(dá)，其大小約91.5和55.0 kD，均能與Anti-Trx抗體發(fā)生特異性反應(yīng)?！窘Y(jié)論】HSC70和HSP40蛋白在魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中高度保守，經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)獲得的金魚(yú)融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40為可溶性表達(dá)，且攜帶有Trx標(biāo)簽，能與Anti-Trx抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，可作為互作蛋白用于RNA pull down試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞： 金魚(yú)；HSC70基因；HSP40基因；克??；原核表達(dá)載體

中圖分類號(hào)： S965.811 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）02-0367-08

0 引言

【研究意義】熱激同源蛋白70（HSC70）是70 kD熱休克蛋白家族（Hsp70）的成員之一，與細(xì)胞分化、發(fā)育密切相關(guān)，為組成型表達(dá)蛋白（Gourdon et al.，2000）。HSC70存在于所有原核及真核生物細(xì)胞中，在正常情況下穩(wěn)定表達(dá)，主要參與新生肽鏈的折疊與組裝及蛋白前體轉(zhuǎn)運(yùn)；在環(huán)境脅迫因子（高溫、重金屬和微生物感染等）的刺激下，其表達(dá)量顯著上調(diào)，而參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，即HSC70是生物體抗逆和抗感染的重要分子（Roberts et al.，2010）。HSP40是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一種分子伴侶，作為HSC70的輔助伴侶分子，可獨(dú)自或協(xié)助HSC70完成蛋白折疊、解折疊及調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等，對(duì)逆境條件下蛋白或蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定維持具有重要作用（王偉等，2012；李雨軒和包勇，2016）。因此，研究HSC70和HSP40兩個(gè)基因?qū)沂窘痿~(yú)耐受高溫的生理機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，HSC70基因在許多動(dòng)植物中已被克隆和表達(dá)，主要用于研究揭示其對(duì)動(dòng)植物受環(huán)境脅迫時(shí)的保護(hù)機(jī)制。張拓（2013）研究表明，大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）HSC70基因在25～34 ℃范圍內(nèi)，其表達(dá)量隨溫度升高的變化不明顯。徐凱等（2017）研究證實(shí)，中華蜜蜂受低溫脅迫2 h時(shí)的HSC70-4基因表達(dá)量最低，但脅迫4 h后的表達(dá)量最高，說(shuō)明HSC70-4蛋白是在中華蜜蜂應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮了生理功能作用。Sathyamoorthi等（2017）研究表明，紋鱧（Channa stria-tus）HSC70基因全長(zhǎng)1953 bp，編碼650個(gè)氨基酸，以在紋鱧鰓中的表達(dá)量較高，而在頭腎、血液、脾臟和肝臟中的表達(dá)量較低。HSP40能使依賴于ATP途徑的多肽底物與HSC70有效結(jié)合，主要是通過(guò)增加ATP水解速率刺激HSC70 ATPase（Minami et al.，1996；Fan et al.，2003）?？梢?jiàn)，HSC70在預(yù)防蛋白聚集和介導(dǎo)未折疊多肽復(fù)性中的伴侶功能在很大程度上取決于其與HSP40的配合度。Matsui等（2007）研究表明，在哺乳動(dòng)物中HSC70通過(guò)分子伴侶HSP40、Hip、CHIP、Bag-4等結(jié)合在Bim基因mRNA 3'-UTR富含AU元件的區(qū)域，以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，而B(niǎo)im蛋白的穩(wěn)定表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡（Lee et al.，2004）。吳盈盈等（2017）在研究肺炎鏈球菌HSP40蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)HSP40蛋白可增強(qiáng)NF-κBp65和Akt磷酸化水平，即NF-κB和PI3K-Akt通路參與調(diào)控肺炎鏈球菌HSP40誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鯉科魚(yú)類的鰓小片間隙細(xì)胞在受溫度脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生凋亡，通過(guò)增加鰓的表面積而增強(qiáng)對(duì)水體溶解氧的吸收能力（Sollid et al.，2003）。HSC70基因?qū)囟茸兓舾?，因此研究分析HSC70基因的生物功能對(duì)揭示金魚(yú)受溫度脅迫時(shí)鰓小片間隙細(xì)胞的凋亡機(jī)制具有重要意義，但目前尚無(wú)有關(guān)高溫脅迫金魚(yú)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用RT-PCR克隆金魚(yú)的HSC70和HSP40基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白，明確HSC70和HSP40蛋白的生物學(xué)功能，為揭示金魚(yú)的高溫應(yīng)答機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)動(dòng)物

取健康金魚(yú)（20±5 g）用MS-222麻醉后，采集其鰓組織立刻放入液氮低溫保存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 總RNA提取及cDNA合成

采用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）提取金魚(yú)鰓組織總RNA，再以PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 HSC70和HSP40基因克隆

參考斑馬魚(yú)、普通鯉魚(yú)等同源物種的HSC70和HSP40基因編碼序列（CDS），利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。HSC70-F：5'-GAATTCATGTCCA

AGGGACCAGCT-3'，HSC70-R：5'-CTCGAGTTAGT

CGACCTCCTCGAT-3'；HSP40-F：5'-GAATTCATGG

GAAAAGATTATTAT-3'，HSP40-R：5'-CTCGAGTCA

AGGTGGCAGGATCTGAAC-3'。采用LA-Taq酶體系（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，HSC70基因擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。HSP40基因擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用割膠回收試劑盒回收目的片段。目的基因片段與pMD19-T載體在SolutionⅠ連接體系中16 ℃反應(yīng)3～4 h，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-HSC70和pMD19-T-HSP40。

1. 4 融合蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)

以EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-HSC70和pMD19-T-HSP40及空表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳雙酶切產(chǎn)物并割膠回收目的條帶，用T4連接酶體系連接目的基因與線性空表達(dá)載體pET-32a，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40。其中，表達(dá)載體pET-32a自帶Trx-tag和His-tag標(biāo)簽，以便于目的蛋白的檢測(cè)和純化。以重組的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta表達(dá)菌株，然后將重組菌株置于抗氨芐LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600為0.4～0.5時(shí)加入IPTG（終濃度0.1 mmol/L），16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。采用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎收集到的菌體，分別保存上清液和沉淀懸浮液。用Ni-NTA親和層析純化上清液中的目的蛋白，取純化前后的上清液、沉淀懸浮液按比例加入4×SDS Loading Buffer，并沸水浴10 min使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析（12%分離膠，5%濃縮膠）。SDS-PAGE電泳膠塊采用考馬斯亮藍(lán)染色1 h，脫色液脫色，每隔10 min換一次脫色液，重復(fù)4～5次。

1. 5 Western blotting檢測(cè)

通過(guò)Western blotting檢測(cè)確認(rèn)純化蛋白是否為攜帶Trx-tag標(biāo)簽的融合蛋白。取已純化的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40上清液，按比例加入4×SDS Loading Buffer，沸水浴10 min使蛋白樣品變性，在SDS-PAGE分析的基礎(chǔ)上，以硝酸纖維素膜為轉(zhuǎn)移膜、Anti-Trx為一抗、Anti-Mouse IgG為二抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 金魚(yú)HSC70和HSP40基因克隆及測(cè)序結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在2000 bp附近出現(xiàn)金魚(yú)HSC70基因CDS序列的目的條帶（圖1-A），而1000 bp附近出現(xiàn)金魚(yú)HSP40基因CDS序列的目的條帶（圖1-B），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果表明，金魚(yú)HSC70基因CDS序列全長(zhǎng)1950 bp，編碼650個(gè)氨基酸（圖2）；金魚(yú)HSP40基因CDS序列全長(zhǎng)996 bp，編碼332個(gè)氨基酸（圖3）。

2. 2 氨基酸序列生物信息學(xué)分析結(jié)果

在GenBank中搜索斑馬魚(yú)（Zebrafish）、草魚(yú)（Grass carp）、金線鲃（Golden-line barbel）、人類（Humon）和家鼠（House mouse）等的HSC70基因序列并翻譯成氨基酸序列，然后導(dǎo)入Clustal Omega中進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果（圖4）表明，金魚(yú)HSC70氨基酸序列與斑馬魚(yú)、人類、家鼠、金線鲃、草魚(yú)的相似度分別為96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%，說(shuō)明HSC70蛋白在金魚(yú)同源物種及哺乳動(dòng)物中高度保守。相同方法分析可知，金魚(yú)HSP40氨基酸序列與斑馬魚(yú)的相似度達(dá)100.00%，即完全一致（圖5），與普通鯉魚(yú)（Common carp）、金線鲃、人類和家鼠的相似度均為94.12%，也說(shuō)明HSP40蛋白在魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中高度保守。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

選取一些具有代表性的魚(yú)類及人類和家鼠的HSC70和HSP40基因CDS序列，利用MEGA 5.0分別構(gòu)建基于HSC70和HSP40基因CDS序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。由圖6可看出，在基于HSC70基因CDS序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，金魚(yú)和斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最近；在基于HSP40基因CDS序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，金魚(yú)和金線鲃、普通鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)等同屬鯉科魚(yú)類的親緣關(guān)系最近?？傮w上，HSP40基因較HSC70基因更保守。

2. 4 原核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)載體pET-32a-HSC70大小約7850 bp（圖7-A），原核表達(dá)載體pET-32a-HSP40大小約6900 bp（圖7-B），與預(yù)期結(jié)果相符。采用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定原核表達(dá)載體，均能獲得大小約6000 bp的pET-32a載體條帶及對(duì)應(yīng)的目的基因條帶（圖7-C），說(shuō)明HSC70和HSP40基因CDS序列已成功克隆至pET-32a載體上，構(gòu)建獲得預(yù)期的原核表達(dá)載體。

2. 5 融合蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

原核表達(dá)載體pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40轉(zhuǎn)化Rosetta表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40以Ni-NTA親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，融合蛋白Trx-HSC70約91.5 kD，融合蛋白Trx-HSP40約55.0 kD，與預(yù)期結(jié)果相符。融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40均為可溶性表達(dá)，純化后的電泳圖雜帶較少，目的條帶清晰（圖8）。

2. 6 融合蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40均能與Anti-Trx抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，其中，融合蛋白Trx-HSC70在92.0 kD附近出現(xiàn)單一目的條帶，而融合蛋白Trx-HSP40在55.0 kD偏下處出現(xiàn)單一目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，即可確定原核表達(dá)獲得的融合蛋白是目的蛋白。

3 討論

HSP70家族高度保守，是迄今為止研究最深入的熱激蛋白家族（Mayer and Bukau，2005；Li et al.，2012），能被各種誘導(dǎo)壓力源如微生物感染、缺氧條件、滲透脅迫、溫度脅迫等誘導(dǎo)表達(dá)。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70家族基因表達(dá)水平上調(diào)，可抑制應(yīng)激激酶活性，抵制細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用（Samali and Cotter，1996）。HSC70是HSP70家族的組成型蛋白成員之一，在正常細(xì)胞中均有表達(dá)。HSP40屬于小分子量熱激蛋白家族，在生物個(gè)體中分布最廣泛，是HSP70家族的輔助分子伴侶（王偉等，2012；李雨軒和包勇，2016）。在哺乳動(dòng)物中，HSC70蛋白在HSP40分子伴侶的協(xié)同作用下，能與Bim基因mRNA 3'-UTR富含AU原件的區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)Bim基因發(fā)揮促凋亡作用（Lee et al.，2004）。Schroderus等（2010）研究表明，大鼠通過(guò)上調(diào)大腦皮層和小腦中的HSC70轉(zhuǎn)錄水平以響應(yīng)熱應(yīng)激。Li等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)軟殼海龜在熱應(yīng)激條件下，HSC70轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)，其蛋白相對(duì)表達(dá)量增加數(shù)十倍。此外，熱激蛋白家族在Caspase依賴型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著十分復(fù)雜的角色。一方面，由于熱激蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能，可抑制細(xì)胞凋亡；另一方面，熱激蛋白作為一種關(guān)鍵的信號(hào)蛋白分子伴侶又直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡（秦佳等，2007）。

目前，有關(guān)HSP70家族的研究主要集中在組織表達(dá)差異方面。本研究成功克隆獲得金魚(yú)HSC70和HSP40基因，并通過(guò)原核誘導(dǎo)表達(dá)獲得相應(yīng)的融合蛋白，為后續(xù)研究二者對(duì)Bim基因穩(wěn)定性的影響打下了基礎(chǔ)。金魚(yú)HSC70基因CDS序列全長(zhǎng)1950 bp，編碼650個(gè)氨基酸；金魚(yú)HSP40基因CDS序列全長(zhǎng)996 bp，編碼332個(gè)氨基酸；二者經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白Trx-HSC70、Trx-HSP40約91.5和55.0 kD，且均能與Anti-Trx抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。周錦勇等（2009）通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體HSC70-pRSET-A成功表達(dá)出70.0 kD的目的蛋白。周小飛（2011）克隆獲得的草魚(yú)HSC70 cDNA序列全長(zhǎng)2449 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?953 bp。在遺傳進(jìn)化方面，金魚(yú)HSC70氨基酸序列與斑馬魚(yú)、人類、家鼠、金線鲃、草魚(yú)的相似度分別為96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%；而金魚(yú)HSP40氨基酸序列與斑馬魚(yú)的氨基酸序列完全一致（相似度100.00%），與普通鯉魚(yú)、金線鲃、人類和家鼠的相似度均為94.12%，說(shuō)明二者在魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中高度保守。但有關(guān)金魚(yú)HSC70是否通過(guò)與HSP40協(xié)同作用結(jié)合在Bim基因上以穩(wěn)定mRNA，進(jìn)而促進(jìn)金魚(yú)特定細(xì)胞凋亡以緩解高溫癥狀，尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

HSC70和HSP40蛋白在魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中高度保守，經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)獲得的金魚(yú)融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40為可溶性表達(dá)，且攜帶有Trx標(biāo)簽，能與Anti-Trx抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，可作為互作蛋白用于RNA pull down試驗(yàn)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）