裴亞瓊，　張　倩，　胡倩倩，　李升和，　金光明，　靳二輝

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽　233100)

硼是自然界中廣泛分布的一種礦物元素，其理化性質(zhì)介于金屬和非金屬之間，對植物和動物機體均具有重要的生物學功能[1]。 相關研究證實，硼是植物必需微量元素，也是動物可能的必需微量元素之一[2]。當硼缺乏或者攝入不足，可引起動物生殖系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的損傷[3]。然而，適量的補充硼則能夠抑制腫瘤細胞的生長，對宮頸癌、前列腺癌和其他癌癥的治療有很大有益作用[4-5]；研究證實，在基礎日糧中添加適宜濃度的硼，能夠顯著提高豬的骨骼強度[6]。但是，硼過量攝入或者長期暴露，則對動物機體產(chǎn)生明顯損傷甚至毒性作用。如Geyikoglu等研究結果顯示，高劑量硼可使胸肌纖維內(nèi)葡萄糖、糖原、乳酸和ATP等能量代謝產(chǎn)物濃度降低[7]；此外，飲水補充高劑量硼還可以損傷大鼠的胰腺和腎上腺組織結構，抑制胰腺和腎上腺的生長發(fā)育[8-9]。

對免疫系統(tǒng)的研究也發(fā)現(xiàn)，飲水添加 100 mg/ L硼對3～6周固始雞免疫器官的發(fā)育有明顯促進作用，而添加高劑量硼 (大于200 mg/L)則有明顯抑制甚至毒性作用，表現(xiàn)為中樞免疫器官中淋巴細胞急劇減少，器官重量明顯降低，組織結構出現(xiàn)異常，同時外周免疫器官的組織結構也出現(xiàn)明顯損傷，發(fā)育受阻[10]。江妍等研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充10～40 mg/L的硼能夠增加60 d大鼠脾臟重量和器官指數(shù)，表現(xiàn)為增大脾小結面積和動脈周圍淋巴鞘厚度，使脾索增粗，脾竇變窄，淋巴細胞數(shù)量增加；而添加480和640 mg/L硼可顯著降低60 d大鼠脾臟重量與器官指數(shù)，造成脾臟組織結構模糊[11]。綜上所述，不同劑量硼對免疫器官的發(fā)育及其免疫功能產(chǎn)生了明顯不同的作用，但這種作用是如何產(chǎn)生的，其影響機制是什么，仍不清楚。因此，本文選用大鼠脾臟淋巴細胞為試驗對象，通過體外添加不同劑量硼酸研究其對淋巴細胞的毒性作用及增殖和凋亡的影響，為揭示硼影響免疫器官發(fā)育的作用機制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試驗動物飼養(yǎng)試驗選用清潔級SD雄性大鼠(2月齡)，購自于南京青龍山實驗動物繁殖場。大鼠飼養(yǎng)于全膜終端獨立通氣籠盒(IVC)內(nèi)，嚴格按照IVC標準進行飼養(yǎng)。環(huán)境溫度25～27 ℃，濕度55～63%，光照14 h。飼喂顆粒飼料及蒸餾水，自由飲水和采食。大鼠顆粒飼料(許可證號：SCXK(浙)2014-001)的營養(yǎng)水平。購自于南京青龍山實驗動物繁殖場。其營養(yǎng)成分為：粗蛋白≥18.15%，粗脂肪≥4.03%，粗纖維≥5.12%，粗灰分7.94%，鈣1.43%，磷0.87%，硼1.96 mg/kg。

1.1.2主要試劑Hank's溶液(HyClone 中國，批號AB10165471)；RIPM-1640(HyClone中國，批號AB10128297)；紅細胞裂解液(biosharp中國，批號BL503A)；青鏈霉素(biosharp中國，批號6607731)；胎牛血清(Solarbio中國，批號S9040)；硼酸為分析純，純度≥99.5%，硼含量≥17.4%(國藥集團化學試劑有限公司，批號20120524)； MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(博士德中國生物工程有限公司，批號AR1156)；Cell-Counting Kit-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)博士德中國生物工程有限公司，批號AR1160-100)；CellTrase CFSE(invitrogen中國，批號C34554)；細胞凋亡試劑盒(美國BD公司，批號556547)。

1.2　方法

1.2.1大鼠脾臟淋巴細胞分離大鼠經(jīng)乙醚麻醉后頸椎脫臼致死，于超凈工作臺上打開胸腔，無菌取出脾臟；剪去表面脂肪及白膜，眼科剪剪碎脾臟，用無菌注射器內(nèi)芯小心研磨后，經(jīng)200目的尼龍篩過濾；用Hank's溶液洗滌細胞沉淀2次，加入紅細胞裂解液4 ℃裂解2～3 min，再分別用Hank's溶液和RIPM-1640洗滌裂紅后的細胞沉淀，離心棄上清抽取中層細胞，將細胞重懸于新鮮的1640完全培養(yǎng)基(含5%胎牛血清及 0.5%青鏈霉素)中即為脾臟淋巴細胞。

1.2.2細胞毒性試驗取2月齡雄性SD大鼠1只，無菌分離脾臟淋巴細胞，將分離得到的脾臟淋巴細胞制備成單細胞懸液，在細胞瓶中培養(yǎng)至對數(shù)增長期，調(diào)整細胞懸液濃度為104/ mL加入96孔板，分為試驗I-XIII組，分別加入0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8、10、20、40、80、100 mmol/L的硼酸處理(硼酸濃度為計算值，下同)，同時設置對照組及空白組，對照組只加細胞懸液不加藥物處理，空白組只加細胞培養(yǎng)液，每組設置5個重復孔，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后， 按照MTT和Cell-Counting Kit-8試劑盒要求進行后續(xù)操作，并計算淋巴細胞的抑制率與增殖率，抑制率=(樣本OD值-空白OD值)/(對照OD值-空白OD值)，增殖率=1-抑制率。

1.2.3淋巴細胞增殖和凋亡檢測取2月齡SD雄性大鼠1只，無菌分離脾臟淋巴細胞，將分離得到的脾臟淋巴細胞制備成單細胞懸液，調(diào)整濃度為10.6/ mL加入24孔板，根據(jù)細胞毒性試驗結果，分為試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅺ和Ⅻ組，分別加入0.4、1、2、4、40、80 mmol/L的硼酸，同時設置對照組，對照組只加細胞懸液不加藥物處理，每組設置3個重復孔，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照CFSE和凋亡試劑盒說明進行后續(xù)處理，并上流式細胞儀檢測，然后用FLOWJO 7.6.0軟件分析試驗結果。

2　結果

2.1　硼的細胞毒性作用

MTT法檢測硼對脾臟淋巴的毒性作用(圖1a和圖2a)。由圖1a可知，試驗II～VII組脾臟淋巴細胞抑制率與對照組相比均明顯降低，其中試驗III組顯著降低27.8%(P<0.05)，而試驗X～XIII組抑制率分別極顯著升高38.60%、52.00%、72.40%和77.20%(P<0.01)。由圖2a可知，試驗II～VII組淋巴細胞增殖率與對照組相比明顯升高，其中試驗III組顯著升高27.80%(P<0.05)，而試驗VIII～XIII組增殖率明顯降低，其中試驗X～XIII組分別極顯著降低了38.60%、52.00%、72.40%和77.20%(P<0.01)。

CCK-8法檢測硼對脾臟淋巴的毒性作用(圖1b和圖2b)。由圖1b可知，試驗II和III組脾臟淋巴細胞抑制率與對照組相比明顯降低，但差異不顯著(P>0.05)，而IV和IX組抑制率顯著升高32.30%和30.20%(P<0.05)，試驗X、XI、XII、XIII組抑制率分別極顯著升高60.70%、74.80%、69.70%和84.70%(P<0.01)。由圖2b可知，試驗II和III組脾臟淋巴細胞增殖率與對照組相比有所升高，但差異不顯著(P>0.05)，而X～XIII組與對照組相比分別極顯著降低53.00%、69.20%、73.20%和83.40%(P<0.01)。

圖1　硼對脾臟淋巴細胞的抑制率的影響

圖2　硼對脾臟淋巴細胞增殖率的影響

2.2　硼對脾臟淋巴細胞增殖與凋亡的影響

不同濃度硼對淋巴細胞增殖的影響(圖3a)。圖3a最右邊的峰代表母代細胞，其左邊各峰依次代表不同的子代細胞，子代峰的數(shù)量越多、面積越大、高度越高表示熒光強度越強，說明細胞增殖明顯，反之則說明增殖受阻。試驗III組子代細胞峰值最高，面積最大 ，說明熒光強度最強，增殖最多(圖3a-C)；試驗XI和XII組的子代細胞熒光強度較對照組顯著降低，其中試驗XII組的峰值最低，面積最小，說明增殖最少(圖3a-G和H)。不同濃度硼對淋巴細胞增殖率的影響(圖4a)。與對照組相比，試驗II、III、V、VI和VII組的增殖率明顯升高，其中試驗Ⅲ組極顯著升高10.60%(P<0.01)，而試驗XI和XII組的增殖率則是極顯著的降低8.80%和9.10%(P<0.01)。

不同濃度硼對淋巴細胞凋亡的影響(圖3b)。由圖3b可知，圖中Q1代表細胞碎片，Q2代表凋亡晚期的細胞，Q3代表凋亡早期的細胞，Q4代表活細胞，其中Q2和Q3統(tǒng)稱為凋亡細胞。試驗Ⅲ組的活細胞數(shù)明顯在所有組中最多，而凋亡象限中的細胞數(shù)量最少(圖3b-C)；而Ⅺ和Ⅻ組的活細胞數(shù)量明顯減少，凋亡細胞數(shù)量明顯增多(圖3b-G和H)。不同濃度硼對淋巴細胞凋亡率的影響(圖4b)，與對照組相比，試驗Ⅱ、Ⅲ和Ⅺ組脾臟淋巴細胞凋亡率明顯降低，其中試驗Ⅲ組的凋亡率顯著降低5.60%(P<0.05)，而試驗Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ和Ⅻ組的凋亡率明顯升高，其中Ⅺ和Ⅻ組分別極顯著升高5.80%和18.20%(P<0.01)。

圖3　硼對脾臟淋巴細胞增殖和凋亡的影響

圖4　硼對脾臟淋巴細胞增殖率與凋亡率的影響

3　結論與討論

3.1　適量的添加硼可對脾臟淋巴細胞產(chǎn)生有益作用

脾臟是動物機體重要的外周淋巴器官，具有造血、濾血、清除衰老的血細胞及參與免疫反應等功能，同時也是免疫應答的主要場所，機體內(nèi)大多數(shù)的體液免疫和細胞免疫都是在脾臟內(nèi)完成的[12]。脾臟免疫功能的正常發(fā)揮與其生長發(fā)育和組織結構密切相關，而脾臟則是由大量的淋巴細胞組成的，因此可以說，脾臟生長發(fā)育的優(yōu)劣取決于脾臟內(nèi)淋巴細胞的增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，飲水補充20和40 mg/L硼不僅可升高血清IgG水平、血紅蛋白含量及白細胞、紅細胞、淋巴細胞和單核細胞數(shù)，引起脾臟免疫細胞CD3+T細胞數(shù)量增多，增強機體的非特異性和特異性免疫反應，而且還能増加脾臟的CD4+T細胞數(shù)和CD4+/ CD8+T細胞比值，促進脾臟合成分泌白介素IL-2、干攏素IFN-γ和IL-4，增強機體的細胞免疫功能[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)淋巴細胞時，添加0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L的硼酸，可以明顯提高脾臟淋巴細胞的增殖率;其中添加量為0.4 mmol/L時，可以顯著促進淋巴細胞的增殖。這可能是因為硼對動物機體的細胞膜功能和酶促反應均起著著重要的作用，適量的補充硼，可以增強淋巴細胞細胞膜的功能及相關酶的活性[14]，從而加快細胞的分裂，使增殖率升高；同時，還有研究表明，硼可以誘導細胞分裂增殖相關基因的RNA轉錄，增加RNA含量，促進相關蛋白的表達，進而刺激脾臟淋巴細胞的增殖[15]。

3.2　高劑量的添加硼則對脾臟淋巴細胞產(chǎn)生毒性作用

與其它的微量營養(yǎng)元素的作用類似，硼對動物機體的影響呈“U”型曲線，適宜濃度的硼可以促進組織器官的發(fā)育，但超過一定劑量時，組織、器官因達到而授極限則會對機體產(chǎn)生有害的影響[16]。研究發(fā)現(xiàn)，飲水添加硼160～320 mg/L對大鼠胸腺組織結構及細胞免疫功能有一定不良影響，當硼添加量達到640 mg/L時，大鼠胸腺的發(fā)育、組織結構及胸腺內(nèi)的淋巴細胞增殖分化均受到明顯的抑制[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，當添加量達到20 mmol/L以上時，淋巴細胞的抑制率顯著升高，凋亡率也開始顯著上升，對細胞的毒性作用明顯增強；當添加量達到100 mmol/L時，毒性作用最為顯著。這可能是因為高硼改變了培養(yǎng)液的pH影響了細胞膜的功能，從而影響了細胞內(nèi)各項酶的活性，因此對細胞產(chǎn)生了毒害作用[18]，使凋亡率升高。也有研究證實，長期的硼壓力(640 mg/L)能夠通過TLR3/4通路加速胸腺細胞的更新和死亡，TLR活性的降低可能促使硼應激下的免疫抑制作用[19]，這也能使得淋巴細胞的凋亡率升高。此外，硼對一些大分子物質(zhì)的代謝也能起到作用。有報道指出，硼可以通過調(diào)節(jié)NAPHD的生成來調(diào)節(jié)胰島素的釋放，并通過影響胰島素、甲狀腺激素和腎上腺素的水平來影響糖類、脂類和蛋白質(zhì)的代謝[20-22]。所以，高劑量的硼能使得淋巴細胞的代謝功能受到抑制，從而加速細胞的凋亡。

綜上所述，當體外培養(yǎng)大鼠脾臟淋巴細胞添加0.4 mmol/L的硼酸時，可以顯著促進脾臟淋巴細胞的增殖，對淋巴細胞的生長有明顯的促進作用；但是當添加量達到20 mmol/L時，則對淋巴細胞產(chǎn)生了明顯的毒害作用，不利于其生長發(fā)育。