孫杰，付立芳

（1.山東醫(yī)學高等?？茖W校 中醫(yī)學教研室 山東 臨沂 276000；2.山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院 呼吸內科，山東 臨沂 276002）

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個漸進過程，從正常胃黏膜、腸上皮化生、異型增生向胃癌的發(fā)生、發(fā)展進程中有多種基因的參與[1]。含有膽汁酸的胃十二指腸反流引起的胃黏膜慢性炎癥，進而發(fā)生胃黏膜腸上皮化生[2]。目前有研究表明，Krüppel樣因子5（Krüppellike factor 5,KLF5）在慢性胃炎和腸上皮化生的表達與正常對照組相比，呈上升趨勢[3-4]。因此，本文通過脫氧膽酸（deoxycholic acid,DCA）誘導胃黏膜上皮細胞，探究KLF5是否參與DCA誘導的腸上皮化生的發(fā)生及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

胃黏膜上皮細胞GES-1（中國科學院上海細胞庫）。選取山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院2012～2015年的56例胃黏膜標本，其中30例正常胃黏膜，26例腸上皮化生。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。鼠抗KLF5、TFF2、VIL1、CDX2、Wnt3a、β-catenin、多克隆抗體、β-actin鼠抗單克隆抗體、羊抗鼠二抗（HRP）購自英國Abcam公司，MTT、二甲基亞砜、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2　方法

1.2.1正常胃黏膜和腸上皮化生組織的選取正常胃黏膜30例，其中，男性13例，女性17例；腸上皮化生26例，其中，男性16例，女性10例。以上組織均置于-80℃中保存，用于提取蛋白和mRNA。

1.2.2胃黏膜上皮細胞的培養(yǎng)和轉染GES-1細胞在含10%胎牛血清、100μ/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中生長。將細胞分為兩組，應用1 mol/L氯化氫調定培養(yǎng)基pH值至7.2，采用不同濃度（100、200和500μmol/L）的DCA處理細胞12 h，置于37℃、5% CO2孵箱中孵育?？瞻讓φ战M為不含DCA的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.3細胞轉染將GES-1細胞分為空白對照組、DCA組、陰性對照組及KLF5沉默組。細胞長至50%～60%密度時，分別將KLF5 siRNA和陰性序列對照按50 nmol/L濃度轉染GES-1細胞，24 h后更換為不含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，并加入500μmol/L DCA或者溶劑對照（Veh）處理細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞感染情況。用Western blot檢測驗證KLF5沉默的效率。

1.2.4MTT法MTT法檢測細胞增殖。按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗后加入MTT，37℃溫育4 h，加入二甲基亞砜150μl/孔，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解，用酶標儀在570 nm處測吸光度值。

1.2.5流式細胞術按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，PBS清洗，參照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測分別取正常胃黏膜、腸上皮化生組織，以及DCA處理GES-1細胞樣品，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃條件下用抗KLF5、Wnt3a和β-actin（均為1∶300）的一抗孵育過夜，PBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用增強化學發(fā)光法發(fā)光液在暗室曝光并壓片。將GES-1細胞分為空白對照組、DCA組、陰性對照組及KLF5沉默組，按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，按照上述方法檢測TFF2、VIL1和CDX2蛋白的表達。將GES-1細胞分為空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、氯化鋰LiCl（Wnt通路激活劑）組及LiCl+KLF5沉默組，按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，按照上述方法檢測Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白的表達。

1.2.7實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分別取正常胃黏膜、腸上皮化生組織，以及DCA處理GES-1細胞樣品。采用Trizol法分別提取總RNA，并檢測其純度及完整性。按照逆轉錄試劑盒說明書生成cDNA，擴增cDNA，基因擴增成功后，采用2-△△Ct法，對KLF5和Wnt3a的含量進行分析。將GES-1細胞分為空白對照組、DCA組、陰性對照組及KLF5沉默組，按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，按照上述方法檢測TFF2、VIL1和CDX2 mRNA的表達。將GES-1細胞分為空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組，按分組收集轉染48 h后的GES-1細胞，按照上述方法檢測Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA的表達。

1.3　統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　KLF5和Wnt3a在腸上皮化生組織中異常表達

2.1.1KLF5和Wnt3a蛋白腸上皮化生組織中KLF5和Wnt3a蛋白相對表達量分別為（2.37±0.06）和（2.32±0.07）；正常胃黏膜中KLF5和Wnt3a蛋白相對表達量分別為（1.02±0.08）和（1.00±0.07）。兩組KLF5和Wnt3a蛋白表達水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=80.350和98.002，均P=0.000），腸上皮化生組織中KLF5和Wnt3a蛋白表達升高。見圖1。

圖1　正常胃黏膜和腸上皮化生組織中KLF5、Wnt3a蛋白的表達（±s）

2.1.2KLF5和Wnt3a mRNA腸上皮化生組織中KLF5和Wnt3a mRNA相對表達量分別為（2.14±0.06）和（2.22±0.07）；正常胃黏膜中KLF5和Wnt3a mRNA相對表達量分別為（1.00±0.06）和（1.00±0.08）。兩組KLF5和Wnt3a mRNA表達水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=70.910和70.817，均P=0.000），腸上皮化生組織中KLF5和Wnt3a mRNA表達升高。見圖2。

圖2　正常胃黏膜和腸上皮化生組織中KLF5和Wnt3a mRNA表達水平比較（±s）

2.2　DCA誘導GES-1細胞中KLF5和Wnt3a的表達

2.2.1KLF5和Wnt3a蛋白100、200和500μmol/L DCA組，以及空白對照組的KLF5蛋白相對表達量分別 為（1.26±0.07）、（1.63±0.06）、（2.47±0.06） 和（1.00±0.06）；100、200和 500μmol/L DCA 組，以及空白對照組的Wnt3a蛋白相對表達量分別為（1.20±0.07）、（1.59±0.09）、（2.34±0.08）和（1.00±0.07）。各組細胞中KLF5和Wnt3a蛋白表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=268.043和143.273，均P=0.000），隨著DCA濃度增加，GES-1細胞中KLF5和Wnt3a的表達水平逐漸升高。見圖3。

2.2.2KLF5和 Wnt3a mRNA100、200和 500μmol/L DCA組，以及空白對照組的KLF5 mRNA相對表達量分別為（1.24±0.08）、（1.74±0.06）、（2.21±0.06）和（1.00±0.05）；100、200 和 500μmol/L DCA 組，以及空白對照組的Wnt3a mRNA相對表達量分別為（1.20±0.05）、（1.73±0.08）、（2.28±0.07）和（1.00±0.06）。各組細胞中KLF5和Wnt3a mRNA表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=179.614和209.881，均P=0.000），KLF5和Wnt3a mRNA表達水平呈劑量依賴效應。KLF5和Wnt通路可能在胃黏膜腸上皮化生中發(fā)揮重要作用。見圖4。

圖3　不同濃度DCA對GES-1細胞中KLF5和Wnt3a蛋白表達的影響（±s）

圖4　不同濃度DCA對GES-1細胞中KLF5和Wnt3a mRNA 表達的影響（±s）

2.3　KLF5沉默抑制DCA誘導的GES-1細胞增殖并促進凋亡

2.3.1KLF5蛋白空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的KLF5蛋白相對表達量分別為（1.00±0.06）、（2.45±0.08）、（2.36±0.06）和（0.11±0.06），經方差分析，差異有統計學意義（F=822.422，P=0.000），si-KLF5轉染后，細胞中KLF5蛋白表達降低。見圖5。

圖5　各組GES-1細胞中KLF5蛋白的表達（±s）

2.3.2增殖率空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組GES-1細胞增殖率分別為（100.00±3.46）%、（125.00±3.60）%、（123.00±3.60）% 和（102.00±4.58）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=36.136，P=0.000），DCA促進GES-1細胞增殖，而將KLF5沉默后，DCA的促增殖作用被抑制。見圖6。

圖6　各組GES-1細胞增殖率比較（±s）

2.3.3凋亡率空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組GES-1細胞凋亡率分別為（18.70±0.72）%、（10.30±0.70）%、（9.80±0.79）%和（17.80±0.79）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=119.419，P=0.000），DCA 抑制GES-1細胞凋亡，而KLF5沉默后，DCA的抑制凋亡作用被抑制。DCA可能通過KLF5影響GES-1細胞的增殖和凋亡。見圖 7、8。

圖7　各組GES-1細胞凋亡情況

圖8　各組GES-1細胞凋亡率比較（±s）

2.4　KLF5沉默抑制DCA誘導的GES-1細胞腸上皮化生

2.4.1TFF2、VIL1和CDX2蛋白空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的TFF2蛋白相對表達量分別為（1.00±0.05）、（2.46±0.08）、（2.38±0.09）和（1.09±0.08），經方差分析，差異有統計學意義（F=301.250，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的VIL1蛋白相對表達量分別為（1.00±0.05）、（2.39±0.09）、（2.37±0.07）和（1.11±0.05），經方差分析，差異有統計學意義（F=385.109，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的CDX2蛋白相對表達量分別為（1.00±0.06）、（2.52±0.08）、（2.51±0.09）和（1.02±0.05），經方差分析，差異有統計學意義（F=413.707，P=0.000）。DCA升高TFF2、VIL1和CDX2蛋白表達水平，而KLF5沉默后DCA的作用被抑制。見圖9。

2.4.2TFF2、VIL1和CDX2 mRNA空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的TFF2 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.05）、（2.35±0.05）、（2.37±0.06）和（1.11±0.08），經方差分析，差異有統計學意義（F=418.568，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的VIL1 mRNA相對表達量分別為（1.02±0.03）、（2.32±0.05）、（2.29±0.05）和（1.10±0.07），經方差分析，差異有統計學意義（531.171，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組的CDX2 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.04）、（2.41±0.08）、（2.43±0.05）和（1.05±0.08），經方差分析，差異有統計學意義（F=452.901，P=0.000）。DCA 升 高 TFF2、VIL1和CDX2 mRNA表達水平，而KLF5沉默后DCA的作用被抑制。DCA可能通過KLF5誘導胃黏膜腸上皮化生。見圖10。

圖9　各組GES-1細胞中TFF2、VIL1和CDX2 蛋白的表達（±s）

圖10　各組GES-1細胞中TFF2、VIL1和CDX2 mRNA表達水平比較（±s）

2.5　KLF5促進DCA誘導的GES-1細胞腸上皮化生

2.5.1Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的Wnt3a蛋白相對表達量分別為（1.01±0.06）、（2.38±0.06）、（2.26±0.05）、（1.02±0.05）、（2.36±0.08） 和（2.32±0.08）， 經 方差分析，差異有統計學意義（F=320.400，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的β-catenin蛋白相對表達量分別為（0.98±0.06）、（2.32±0.07）、（2.31±0.07）、（1.08±0.07）、（2.33±0.08） 和（2.40±0.07）， 經 方差分析，差異有統計學意義（F=266.022，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的CDX2蛋白相對表達量分 別 為（1.02±0.06）、（2.48±0.06）、（2.34±0.08）、（1.02±0.08）、（2.37±0.05） 和（2.38±0.06）， 經 方差分析，差異有統計學意義（F=312.093，P=0.000）。DCA激活Wnt通路Wnt3a、β-catenin，以及腸上皮化生標志蛋白CDX2蛋白的表達，將KLF5沉默后，Wnt通路蛋白和腸上皮化生標志蛋白表達下降，而Wnt激活劑則使抵消了si-KLF5的作用，激活Wnt通路并升高CDX2的表達。見圖11。

圖11　Wnt激動劑對si-KLF5調節(jié)GES-1細胞中Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白表達的影響（±s）

2.5.2Wnt3a、β-catenin 和 CDX2 mRNA空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的Wnt3a mRNA相對表達量分別為（1.00±0.06）、（2.32±0.07）、（2.28±0.06）、（1.09±0.06）、（2.26±0.06）和（2.23±0.06），經方差分析，差異有統計學意義（F=310.259，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的β-catenin mRNA相對表達量分別為（1.00±0.05）、（2.29±0.06）、（2.25±0.08）、（1.11±0.09）、（2.21±0.08）和（2.20±0.08），經方差分析，差異有統計學意義（F=190.732，P=0.000）；空白對照組、DCA組、陰性對照組、KLF5沉默組、LiCl組及LiCl+KLF5沉默組的CDX2 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.03）、（2.31±0.06）、（2.26±0.06）、（1.05±0.04）、（2.27±0.06）和（2.25±0.06），經方差分析，差異有統計學意義（F=400.107，P=0.000）。DCA激活Wnt通路Wnt3a、β-catenin，以及CDX2 mRNA的表達，將KLF5沉默后，Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA表達下降，而Wnt激活劑則使抵消了si-KLF5的作用，激活Wnt通路并升高CDX2 mRNA的表達。KLF5可能通過激活Wnt/β-catenin通路促進DCA誘導的胃黏膜腸上皮化生。見圖12。

圖12　Wnt激動劑對si-KLF5調節(jié)GES-1細胞中Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA表達的影響（±s）

3　討論

我國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例占全世界發(fā)病人數的絕大多數。決定胃癌患者預后的關鍵在于早期發(fā)現、診斷和治療。慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生及異型增生是重要的胃黏膜癌前病變[5-6]。因此，胃黏膜腸上皮化生發(fā)病機制的研究，可為胃黏膜異型增生甚至癌變的治療提供新思路。

Krüppel樣基因家族（Krüppel like factor,KLFs）為哺乳類動物的轉求調節(jié)因子，屬于鋅指蛋白轉錄因子家族。其中KLF5又稱為BTEB2和IKLF，屬于KLF家族[7]。KLF5在不同組織不同層次中有廣泛的表達。作為一個基本的轉錄因子，KLF5在細胞周期調控、細胞凋亡、遷移和分化中發(fā)揮必不可少的作用。另外，KLF家族成員KLF2、KLF4、KLF5及KLF8均證實作為致癌因子，促進各種癌癥的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。有研究證明，KLF5協同其他轉錄因子促進胃癌的發(fā)展[11]，而其在癌前病變中的作用并無相關報道。有研究表明，DCA可以誘導食管癌的癌前病變[2]。因此，本文用DCA誘導胃黏膜細胞，觀察KLF5沉默對胃黏膜腸上皮化生的作用。本實驗結果證明，與正常胃黏膜相比，KLF5在腸上皮化生中的表達升高，提示KLF5可能在胃黏膜腸上皮化生中發(fā)揮重要作用。進一步實驗結果表明，與正常胃黏膜上皮細胞相比，DCA誘導胃黏膜腸上皮化生細胞模型中KLF5的表達升高。

細胞增殖和凋亡是保持機體平衡和修復損傷的重要因素。胃黏膜上皮細胞更新非常迅速，研究認為腸上皮化生的發(fā)生是細胞異常增生逐漸積聚的結果[12]。有研究表明，抑制KLF5能夠減輕口腔黏膜癌前病變[13]。KLF5能夠促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進癌癥的發(fā)展[14]。本實驗結果表明，DCA促進GES-1細胞的增殖，并抑制凋亡，而KLF5沉默后抑制DCA對細胞增殖、凋亡的影響。

同源異形盒基因CDX2是一種腸上皮特異性轉錄因子，可控制腸上皮細胞的分化和成熟，在腸上皮化生黏膜中呈高表達[15]。三葉因子家族（trefoil factor family,TFF）是胃腸道黏液細胞分泌的具有≥1個三葉結構域的小分子蛋白質多肽，主要功能是保護黏膜、促進損傷黏膜修復。研究發(fā)現，在TFF2缺陷小鼠模型實驗中，小鼠的胃黏膜增生降低，提示TFF2可能有刺激胃黏膜增殖的作用，增加胃癌發(fā)生的危險性[16]。絨毛蛋白（Villin,VIL）是一種重要的細胞支架蛋白，在刷狀緣上皮細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，VIL1是腸上皮細胞分化和轉移性腸腺癌的標志物，可以輔助明確轉移性腫瘤的來源[17]。因此，TFF2、VIL1和CDX2作為腸上皮化生的標志蛋白，在腸上皮化生過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，Wnt信號通路除參與調控發(fā)育過程外，在癌癥的發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。Wnt途徑激活后，相關的細胞周期和凋亡相關基因、生長因子和黏附分子等開始轉錄，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展[18]。有研究表明，KLF5敲除的小鼠中Wnt通路被抑制，腸上皮穩(wěn)態(tài)被破壞[19]。本實驗結果表明，KLF5沉默抑制DCA對TFF2、VIL1和CDX2的上調作用；另外，在Wnt通路干預后，si-KLF5的作用又被抑制，表明KLF5可能通過Wnt/β-catenin通路促進DCA誘導的腸上皮化生。

綜上所述，本文通過DCA誘導胃黏膜上皮細胞，發(fā)現KLF5沉默明顯抑制DCA誘導的胃黏膜上皮細胞腸上皮化生，表明KLF5可能促進DCA誘導的腸上皮化生，其機制可能是通過激活Wnt/β-catenin通路來實現的。本研究指出KLF5參與DCA誘導的胃黏膜腸上皮化生的發(fā)生，為預防胃癌提供新的靶點。